醫(yī)學分子生物學

醫(yī)學分子生物學名詞解釋：結構基因(structuralgenes)：可被轉錄形成mRNA，并轉譯成多肽鏈，構成各種結構蛋白質，催化各種生化反應的酶和激素等。ORF開放閱讀框架（openreadingframe，ORF）：是指DNA鏈上，由蛋白質合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個連續(xù)編碼。C值(C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。C值矛盾/C值悖論：C值和生物結構或組成的復雜性不一致的現(xiàn)象?；蚪M（genome）：是指生物體全套遺傳信息，包括所有基因和基因間的區(qū)域重疊基因是指同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質分子。SNP單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism）是由基因組DNA上的單個堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。是人群中個體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當一部分還直接或間接與個體的表型差異、對疾病的易感性或抵抗能力、對藥物的反應性等相關。SNP被認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變蛋白質組(proteomics):指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律.質譜技術massspectrometry,MS樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質核比（m/z）的差異來分離并確定分子量開放閱讀框=ORF基因工程又稱為重組DNA技術，是指將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內復制和表達的技術。限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。逆轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板、4種dNTP為底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆轉錄作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依賴DNA的DNA聚合酶作用。粘性末端被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（來自360問答）載體vector指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA。多克隆位點載體上具有多個限制酶的單一切點（即在載體的其他部位無這些酶的相同切點）稱為多克隆位點報告基因（reportergene）：是指處于待測基因下游并通過轉錄和表達水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。轉化以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程稱為轉化（transformation）感受態(tài)細胞細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞稱謂感受態(tài)細胞(competentcell)。堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）條件下，用強陽離子去垢劑SDS破壞細胞壁，裂解細胞，與NaOH共同使宿主細胞的蛋白質與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質粒DNA。核酸變性變性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。核酸復性質粒（plasmid）是指細菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復制和表達其攜帶的遺傳信息。質?？寺≥d體的主要用途：①用于保存和擴增<2Kb目的DNA。②構建cDNA文庫。③目的DNA的測序。④作為核酸雜交時的探針來源。作為克隆載體的質粒應具備哪些特點？（來自360問答）用作克隆載體的理想質粒一般具備下述特點：

①具有松馳型復制子（如ColE1），復制子（replicon）是質粒自我增殖所必不可少的基本條件，并可協(xié)助維持使每個細胞含有一定數(shù)量的質?？截悺?/p>

②在復制子外存在幾個單一的酶切位點（或多克隆位點），以便目的DNA片段插入。

③具有插入失活的篩選標記，理想的質粒載體應具有兩種抗菌素抗性標志，如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）等，以便從平板中直接篩選陽性重組子。

④分子量相對較小和較高的拷貝數(shù)。此外，質粒的缺點是容量較小，一般只能接受小于15kb的外來DNA，插入片段過大會導致重組子擴增速度減慢，甚至使插入片段失活。主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復制子即可。簡述分子克隆技術的基本步驟？一、目的基因的獲取二、載體的選擇三、目的基因和載體的酶切與連接四、重組DNA導入受體細胞五、重組體的篩選和鑒定簡述藍白斑篩選實驗的原理？b-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍白斑篩選）：使用的載體帶有大腸桿菌的DNA短區(qū)段，含有b-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和N端146個氨基酸的編碼信息，這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，宿主細胞攜帶編碼b-半乳糖苷酶C端部分序列，雖然宿主和質粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性的酶蛋白質-b-半乳糖苷酶，這種互補現(xiàn)象叫a互補，在生色物質X-gal和IPTG存在下形成藍色菌落，但在外源基因插入到多克隆位點后，破壞了質粒載體b-半乳糖苷基因讀框，不能編碼b-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。如何進行基因組DNA的提取、純化和鑒定？生物樣本預處理：粉碎組織、理解細胞，DNA釋放、蛋白質沉淀降解。分離：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃纏繞法、異丙醇沉淀法。純化：對基因組DNA粗品通過透析、層析、電泳（PAG、AGE、PFGE）、選擇性沉淀等方法提取特定DNA片段，并通過柱層析、有機溶劑抽提等方法沉淀、洗滌、得到基因組DNA純品。鑒定：濃度鑒定、純度鑒定、完整性鑒定。簡述寡核苷酸探針的設計原則？設計原則：探針長度：一般要求在10～50bpG／C含量為40％～60％探針分子中應避免互補序列避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個，如GGGG-或-CCCC-5、借助計算機相應軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較理想的探針標記物應具有哪些特點？理想的探針標記物應具有以下特點檢測物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值標記物對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低廉4、標記物對檢測方法無干擾。核酸分子雜交的影響因素有哪些？1、探針的選擇；2、探針的標記方法；3、探針的濃度；4、雜交反應溫度；5、雜交反應時間；6、洗膜溫度；7、雜交液。PCR的原理是什么？PCR體系需具備哪些要素？原理：1、PCR技術實際上是模擬體內DNA半保留復制過程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應，由變性－退火－延伸三個基本反應步驟構成。2、在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設擴增效率為100%)。如此反復循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進行擴增。每完成一個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。PCR反應體系：模板（template）；引物（primer）；DNA聚合酶（DNApolymerase）；dNTP；PCRbuffer簡述PCR技術的一般方案。1、50ulPCR反應體系的組成:樣品DNA0.1～1ug；正鏈引物（25umol/L）1.0ul；負鏈引物（25umol/L）1.0ul；dNTP（各2.5mmol/L）4.0ul；10×PCR緩沖液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶1～2.5u；蒸餾的去離子水補至50ul。2、對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。3、PCR儀工作參數(shù)的設置：94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。4、PCR產物的保存：PCR產物于4℃保存。PCR引物的設計原則有哪些？長度15～30b，過短特異性降低，過長則成本增加，產量也下降。引物堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物G+C含量宜在45～55%左右。3、引物內部不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結構；兩個引物之間尤其在3’末端不應有互補鏈存在，不然會形成引物二聚體。4、引物的堿基順序與非擴增區(qū)域同源性小于70%或連續(xù)互補堿基少于8個。要求在引物設計時采用計算機進行輔助檢索分析。5、引物的3′末端與模板DNA一定要配對。另外3′末端的末位堿基最好選T、G、C，而不選A（引物3′末端堿基在錯誤配對時不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異）。6、只要與模板DNA結合的引物長度足夠，引物的5′末端堿基最多可以有10個堿基不與模板DNA匹配，并不影響PCR反應進行。TaqMan熒光定量PCR技術的原理是什么？1、PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，2、3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號；3、探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來；4、熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例。有哪些熒光定量PCR技術？請分別簡述其要點。熒光染料法：SYBRgreen熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。熒光探針法1）Taqman技術：3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號；探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來；熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例。LightCycler探針技術：熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比3）molecularBeacon技術（分子燈塔法）工作原理：包括發(fā)夾形的寡聚核苷酸探針和內部淬滅的熒光團；分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結構,使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導致熒光淬滅；單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補而與之雜交；探針5’和3’端分離,淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消