發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一淀粉酶生產(chǎn)菌的篩選一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶在釀造、紡織、食品加工、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛用途。淀粉酶是一類淀粉水解酶的統(tǒng)稱，它能將淀粉水解成糊精等小分子物質(zhì)并進(jìn)一步水解成麥芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再變藍(lán)色，因此可根據(jù)淀粉培養(yǎng)基上透明圈的大小來判斷所選菌株的淀粉酶活力。三、 實(shí)驗(yàn)用品樣品淀粉含量豐富的土樣。培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，加水至1000ml，。121°C滅菌20min。初篩平板培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，可溶性淀粉2g，瓊脂18g，加水至1000ml，。121C滅菌20min。Lugol碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘溶解于碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足水即可。器材高壓蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，電子天平，電爐，恒溫振蕩器，恒溫培養(yǎng)箱；燒杯，量筒，三角瓶，培養(yǎng)皿，移液管，洗耳球，試管，試管架，接種針，涂布棒。四、 實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基制備：配制肉湯培養(yǎng)基45ml，分裝于250ml三角瓶中，紗布封口，滅菌。配制初篩平板培養(yǎng)基350ml，分裝于500ml三角瓶中，封口膜封口，滅菌。倒平板:將融化的初篩平板培養(yǎng)基冷卻至50?60°C，以無菌操作法倒至已滅菌的培養(yǎng)皿中，至蓋滿底部。冷卻凝固待用。樣品預(yù)處理：取5g土樣接入45ml肉湯培養(yǎng)基中，30C搖床振蕩15min制成土壤懸液，此時(shí)的稀釋度為10-1。另取4支試管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5共5個(gè)梯度，每支試管內(nèi)加入9mL無菌水。用無菌移液管從三角瓶中吸取1mL土壤懸液，加入到10-2試管中混勻，再?gòu)拇嗽嚬苤形?mL加入到10-3試管中，依此類推直至10-5試管。平板涂布分離：分別從不同稀釋度的試管中吸取懸液，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，于30C培養(yǎng)24?48h。菌株檢測(cè)：待初篩平板長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落不同挑取菌落進(jìn)行保存并編號(hào)。同時(shí)，將檢測(cè)試劑（Lugol碘液）加入到平板中，涂布均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株即是產(chǎn)淀粉酶的菌株，記住其編號(hào)，以便進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。6.保存菌種：將得到的菌株轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，30C培養(yǎng)48?72h，待菌苔長(zhǎng)好后，4C保存。五、思考題微生物菌種的分離篩選通常包括哪幾個(gè)部分？實(shí)驗(yàn)二淀粉酶酶活測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗止夤舛确y(cè)定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法從初篩所獲得的菌株中篩選出淀粉酶活力高的菌株二、 實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類酶，包括a-淀粉酶、淀粉1,4-麥芽糖苷酶（B-淀粉酶）、淀粉1,4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1,6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）。a-淀粉酶可以從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的a-1,4糖苷鍵，形成麥芽糖、含6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計(jì)測(cè)定。隨著酶的不斷作用，淀粉長(zhǎng)鏈被切斷，生成小分子糊精，使其對(duì)碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來測(cè)定a-淀粉酶的活力。三、 實(shí)驗(yàn)用品粗酶液實(shí)驗(yàn)一保存的菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。試劑碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，貯于棕色瓶中；比色用稀釋碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：稱取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調(diào)勻，徐徐傾入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100ml，需當(dāng)天配制；的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4-12H2O），檸檬酸，用水溶解并定容至100ml；L乙酸溶液。器材離心機(jī)，分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，試管架，秒表；試管，移液管，燒杯，離心管。四、實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：表2-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)試劑 123456淀粉稀釋液濃度/%淀粉稀釋液/ml0222222緩沖液/ml111111蒸餾水/ml40C水浴中保溫5min11111140°C水浴中保溫30min，加入L乙酸10ml，混勻后吸取反應(yīng)液1ml稀碘液/ml101010101010A660將可溶性淀粉稀釋成％，%，1%，%，2%的稀釋液；吸取淀粉稀釋液加至試管中，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，40C水浴保溫15min；加蒸餾水1ml，40C保溫30min后加入L乙酸10ml；吸取反應(yīng)液1ml，加入稀碘液10ml，混勻，在660nm下測(cè)吸光值A(chǔ)；以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶液的制備將發(fā)酵液離心（5000r/min，10min），取上清液作為粗酶液，以緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，作為待測(cè)酶液。

淀粉酶活力測(cè)定按下列程序操作:試管A（空白）試管B（酶試樣，需作三個(gè)平行試樣）!!加2%淀粉稀釋液加2%淀粉稀釋液!!加緩沖液（搖勻）加緩沖液（搖勻）!40±°C，5min!40土C，5min加蒸餾水（搖勻）加粗酶液（搖勻）|40土C，30min|40土C，30min加乙酸加乙酸1混勻1混勻取反應(yīng)液取反應(yīng)液!!加稀碘液加稀碘液1混勻1混勻測(cè)定A660測(cè)定A660五、注意事項(xiàng)淀粉一定要用少量冷水調(diào)勻，再倒入熱水中溶解，若直接加到熱水中，會(huì)溶解不均勻，甚至結(jié)塊。淀粉液應(yīng)當(dāng)天配制，配好的淀粉液應(yīng)是透明澄清的，不能有顆粒狀物質(zhì)存在。酶液應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)稀釋。六、 作業(yè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。記錄各樣品的A660，并計(jì)算其酶活力，計(jì)算方法參見附錄。七、 思考題測(cè)定酶活力時(shí)，在具體操作上應(yīng)注意哪些問題？為什么測(cè)定酶活力的試劑要在40°C水浴鍋中預(yù)熱？附：酶活力單位的定義：1ml酶液在40C、pH的條件下，每小時(shí)分解的淀粉的毫克數(shù)。表示為u/ml。實(shí)驗(yàn)三淀粉酶生產(chǎn)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆瞻l(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則，熟悉用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)物的形成有著非常重要的影響，其中培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度和通氣狀況是三類最主要的發(fā)酵條件。培養(yǎng)基pH一般指滅菌前的pH，可以酸堿溶液調(diào)節(jié)控制，因發(fā)酵過程中pH會(huì)不斷改變，所以最好用緩沖溶液來調(diào)節(jié)；通氣狀況可用培養(yǎng)基裝量和搖床轉(zhuǎn)速來衡量，封口紗布的厚度也會(huì)影響氧氣的傳遞，一般以6?8層為好。發(fā)酵培養(yǎng)基是指大生產(chǎn)時(shí)所用的培養(yǎng)基，一般碳源含量較高。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基與菌種篩選時(shí)所用培養(yǎng)基不同，以經(jīng)濟(jì)節(jié)約為主，一般選用廉價(jià)的農(nóng)副產(chǎn)品為原料。由于天然原料的組分復(fù)雜，不同批次的原料成分各不相同，因此發(fā)酵前必須進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)菌株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。三、 實(shí)驗(yàn)用品菌種:實(shí)驗(yàn)一篩選得到的淀粉酶生產(chǎn)菌。器材:搖床，高壓滅菌鍋；三角瓶，燒杯，移液管，試管。四、 實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基制備：以黃豆粉、玉米粉、可溶性淀粉、酵母膏作為培養(yǎng)基的主要影響因素，每一因素設(shè)定3個(gè)水平，按表3-1配制培養(yǎng)基(W/V)，另加入Na2HPO4%，(NH4)2SO4%，NH4C1%，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml，6層紗布封口，滅菌。取5ml蒸餾水加入試管中，滅菌。接種：挑取斜面菌苔5環(huán)接入5ml無菌水中，搖勻后用無菌移液管吸取菌懸液，接到每一組培養(yǎng)基中。30°C，150r/min搖床培養(yǎng)36h左右。

結(jié)果測(cè)定:參照實(shí)驗(yàn)三方法測(cè)定菌株在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)的淀粉酶活力。表3-1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)表組別因素A黃豆粉因素B玉米粉因素C淀粉因素D酵母膏酶活力/(U/ml)113%11%13%1%213%22%25%2%313%33%37%3%425%11%25%3%525%22%37%1%625%33%13%2%737%11%37%2%837%22%13%3%937%33%25%1%五、 作業(yè)將酶活力測(cè)定結(jié)果填入表3-1,通過正交分析，確定三個(gè)因素對(duì)酶活力影響的主次順序，并確定最適培養(yǎng)基配方。六、 思考題正交試驗(yàn)原理。實(shí)驗(yàn)四淀粉酶的提取一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆整}析法的基本原理，學(xué)會(huì)用鹽析法提取蛋白質(zhì)。二、 實(shí)驗(yàn)原理鹽析法是加入中性鹽到蛋白質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度開始增大，但隨著繼續(xù)加入鹽，蛋白質(zhì)的溶解度卻逐步減小，并形成沉淀，不同蛋白質(zhì)在不同中性鹽濃度下析出，利用此原理，可對(duì)溶液中的雜蛋白質(zhì)及目的蛋白進(jìn)行分級(jí)沉淀以達(dá)到提取分離的目的。三、 實(shí)驗(yàn)用品粗酶液實(shí)驗(yàn)一保存的菌種進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。器材燒杯，布氏漏斗，真空泵。四、 實(shí)驗(yàn)方法鹽析：取120ml發(fā)酵液倒入燒杯中，調(diào)pH至，加硫酸銨使其濃度達(dá)到40%-42%，加完后靜止數(shù)小時(shí)（3小時(shí)以上），即可抽濾或離心，收集濾餅。加入硫酸銨量的計(jì)算方法：硫酸銨的溶解度在0-30°C變化很少，在水中飽和溶液濃度密度約為ml。在20°C飽和溶液為533g/L，但加入硫酸銨體積會(huì)變大，1L水中加硫酸銨至飽和需加硫酸銨761g?？紤]到溶液硫酸銨體積要增大，則于20C時(shí)使1LM1摩爾濃度硫酸銨溶液增至M2摩爾濃度，所需的硫酸銨量為GG=533（M2-M1）/上式如以飽和