PCR技術(shù)概論課后練習(xí)題

PCR技術(shù)概論

PCR技術(shù)簡史

PCR技術(shù)的基本原理

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增

技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能

在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使

肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分

析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是

生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術(shù)簡史

PCR的最早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致

力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA

變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基

因"。

PCR的實(shí)現(xiàn)1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代

意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提

供以致一種合適的條件一摸板DNA,寡核甘酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA

變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。

PCR的改進(jìn)與完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的

Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

②引物鏈延伸反應(yīng)在37c下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異

性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具

備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此前鈍化，

每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR

技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)

性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐

熱DNA聚合酶。此前具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70c下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來

的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是

原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新前。③大大提高了

擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因

而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多

聚酶(TaqDNAPolymerase)?此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互

補(bǔ)的寡核甘酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：

模板DNA經(jīng)加熱至93"C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA

解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火

(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)

序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP

為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈

互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的"半保留復(fù)制鏈"，而

且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2?4分鐘，2?3小時(shí)就能將待

擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

(Plateau)?到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝

PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)

最終的DNA擴(kuò)增量可用Y=(l+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均

每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%,但在實(shí)際反應(yīng)中平均

效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸

積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)"停滯效

應(yīng)"，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)

物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限

定在兩個(gè)引物鏈6端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所

結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的

DNA為模板，引物是從3,端開始延伸，其5,端是固定的，3'端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不

一，這就是"長產(chǎn)物片段"。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈

(即"長產(chǎn)物片段")結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，由于新鏈模板的5,端序列是固定的，這就

等于這次延伸的片段3,端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序

列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段"。不難看出"短產(chǎn)物片段"是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長

產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，

就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10x擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10?lOOpmol

模板DNA0.1?2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至lOOul

PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)

的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核昔酸鏈做引

物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特

異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的喋吟或喀嚏核甘酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3,端的互補(bǔ)，否則會(huì)形

成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3,端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端

堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這

對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。

引物量：每條引物的濃度0.1?lumol或10?lOOpmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)

果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然

酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U（指總反應(yīng)

體積為1003時(shí)），濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒

狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M

NaOH或IMTris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0?7.5,小量分裝，-20℃冰凍保存。多次

凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50?200umol/L,尤其是注意4種dNTP的

濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起

錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)

的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞

膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與

蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋臼，再用有機(jī)

溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作

為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，

消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫

鼠酸服或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各

種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特

異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

PCR反應(yīng)條件的選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)

反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90?95℃變性，再迅速冷卻至40?60℃,引物退火

并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70?75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿

模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長度為100?300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退

火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍

有較高的催化活性）。

①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情

況下，93℃?94℃imin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，

因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致

PCR失敗。

②退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速

冷卻至40℃?60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模

板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長

度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對(duì)于20個(gè)核甘酸，G+C含量約50%的引物，

55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適

的溫度：

Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）+2（A+T）

復(fù)性溫度=Tm值-（5?10℃）

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，

提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30?60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70?80℃150核甘酸/S/酶分子

70℃60核甘酸/S/酶分子

55℃24核甘酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70?75℃之間，常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不

利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以

內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間lmin是足夠的。3?4kb的靶序列需3?4min；擴(kuò)增10Kb需延伸

至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要

稍長些。

循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。

一般的循環(huán)次數(shù)選在30?40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

特異性強(qiáng)：

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)

原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合

(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持

很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

靈敏度高：

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增

到微克(ug=-6)水平。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度

可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

簡便、快速：

PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和

水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2?4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳

分析，不一定要用同位素，無放射性污