微生物限度檢驗方法驗證方案

微生物限度檢驗方法驗證方案1.適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2.目的通過驗證確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定。3.職責項目責任人：負責驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員：負責驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負責驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC負責人：負責驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標準檢驗操作程序的準確執(zhí)行，負責組織實施。QC檢驗員：負責驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準確性負責。質(zhì)量部經(jīng)理：負責驗證方案及報告的審核和批準。4.內(nèi)容4.1.概述通過驗證以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定；確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結(jié)果符合設(shè)立的驗證標準。4.2細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定。驗證試驗可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進行。4.2.1.驗證用菌株及菌種要求大腸埃希菌【CMCC（B）44102】金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】黑曲霉【CMCC（F）98003】白色念珠菌【CMCC（F）98001】。大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計數(shù)驗證用菌株。驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。4.2.2.驗證菌菌液制備4.2.2.1.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。4.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。4.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。4.2.3.供試液的制備4.2.3.1.無抑菌活性的供試品供試液的制備◆稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）?！艄腆w、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。4.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備當供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：◆培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補至原量?！舯∧み^濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。◆中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當?shù)膶Π被郊姿?，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測定。4.2.4.菌液組

測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.試驗組4.2.5.1.平皿法：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。4.2.5.4.離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。4.2.6.供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。4.2.7.稀釋劑對照組若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。4.2.8.回收率計算4.2.8.1.試驗組回收率計算試驗組的菌回收率＝

試驗組的菌回收率—供試品對照組平均菌落數(shù)

×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

4.2.8.2.稀釋劑對照組回收率計算試驗組的菌回收率＝

稀釋劑對照組平均菌落數(shù)

×100%

菌液組的平均菌落數(shù)

計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。4.2.8.結(jié)果判斷在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70%。4.3.控制菌檢驗方法驗證當建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢驗方法應(yīng)進行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。4.3.1.驗證用菌株大腸埃希菌（Esherichiacoli）【CMCC(B)44102】、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）【CMCC(B)50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）【CMCC(B)10104】驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學特性。4.3.2.菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。4.3.3.陰性菌對照組

設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。4.3.4.試驗組

4.3.4.1.常規(guī)法◆大腸埃希菌

取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規(guī)定檢查?！舸竽c菌群

取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規(guī)定檢查。◆沙門菌

取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查。◆銅綠假單胞菌

取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規(guī)定檢查?！艚瘘S色葡萄球菌

取相當于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。4.3.4.2.培養(yǎng)基稀釋法

供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強的樣品。4.3.4.3.薄膜過濾法

采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。4.3.4.4.離心沉淀集菌法

取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。4.3.4.5.中和法

在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。4.3.5.結(jié)果判斷至少應(yīng)進行3次獨立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進行該供試品控制菌的檢查；若試驗組未檢出