畢氏酵母%28Pichia-pastoris%29感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

畢氏酵母（Pichiapastoris）感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化1、畢氏酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化法（1）試劑1MLiCl（用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌；必要時(shí)用消毒去離子水稀釋?zhuān)?0%PEG3350（SigmaP3640

用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝）2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存注：醋酸鋰對(duì)畢氏酵母無(wú)效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；（2）感受態(tài)畢氏酵母的制備接種Pachiapastoris到50mlYPD培養(yǎng)基中，30℃搖菌過(guò)夜（約24～28h）培養(yǎng)到OD值為0.8～1.0（約108Cells/ml）；收獲細(xì)胞，用25ml無(wú)菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min；重懸細(xì)胞于1ml100mMLiCl溶液中，將懸液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管；離心機(jī)最大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400ul100mMLiCl溶液中；按50ul/管分裝，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化；注：不要將感受態(tài)酵母菌冰?。唬?）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化煮沸1ml鮭魚(yú)精DNA5min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA；將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：50%PEG3350

240ul1MLiCl

36ul2mg/ml單鏈SalmonspermDNA

25ul5～10ug/50ulH2O質(zhì)粒DNA

50ul劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴熱休克20～25min;6000～8000rpm離心收集酵母菌體；重懸酵母于1mlYPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定；2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法（1）試劑緩沖液A：1.0MSorbitol，10mMBicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethyleneglycol緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2MBicine，pH8.35緩沖液C：0.15MNaCl，10mMBicine，pH8.35未污染的新鮮、試劑級(jí)DMSO，-70℃保存注：緩沖液A、B、C均用濾膜過(guò)濾，-20℃保存;將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過(guò)程中迅速下降；如進(jìn)行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進(jìn)行）;（2）待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備接種環(huán)接種Pachiapastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d;挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8；室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次；重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍，-70℃保存（3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ulTE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中；加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚(yú)精DNA）以獲得最大轉(zhuǎn)化率；37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次；取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻；30℃水浴孵育1h；室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中；離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中；將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定；3、畢氏酵母電轉(zhuǎn)化法（1）E.coliTOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備取10ulTOP10F’菌液，接種于200mlLB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37℃，200rpm，16～18小時(shí)。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。37℃，200rpm，培養(yǎng)16～18小時(shí)。滅菌500ml離心管，4℃，4000rpm，20min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10％甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌3次。第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml液體用于重懸菌體。從制得得感受態(tài)細(xì)胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為電壓2500V，時(shí)間5ms。電擊后，往電擊杯中加入800ulSOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5mlEP管中。37℃，150rpm，輕搖45～60min。取全部均勻涂布于含Zeocin25ug/ml的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動(dòng)，37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)。（2）線性化質(zhì)粒DNA對(duì)PichiapastorisGS115的轉(zhuǎn)化取新鮮制備的（或－70℃凍存的）感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍；1）將100μl菌體移出至一新的無(wú)菌Eppendorf管中，加入5－20μg線性化質(zhì)粒（5～10μl），輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中；2)轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5～10分鐘，保持低溫。3)電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓：1500V；電阻：400Ω；電容：25μF；脈沖時(shí)間：10mS；一次電擊。4)電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入1ml4℃預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中；5)取30℃烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作涂布平板，400μl/板3.4畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法

3.4.1菌體的準(zhǔn)備：

1.挑取酵母單菌落，接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜；

2.取100-500μl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜，至OD600達(dá)到1.3~1.5；

3.將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；

4.按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；

5.按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；

6.按步驟3離心，用1ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；

7.備注：可將其分裝為80μl一份的包裝冷凍起來(lái)，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率（2周之內(nèi)）。

3.4.2電擊轉(zhuǎn)化：

8.將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μlTE溶液中，與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；

9.將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；

10.根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)