細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞衰老課件

第十三章程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡一個主動的有基因決定的自動結(jié)束生命的過程。由于受到嚴(yán)格的由遺傳機(jī)制決定的程序性調(diào)控，所以常常被稱為細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老一.動物細(xì)胞的程序性死亡三種方式:凋亡壞死自噬(一)細(xì)胞凋亡概念:受基因控制的主動的結(jié)束生命的過程,是一自然的生理過程.形態(tài)學(xué)特征:凋亡的起始:特化結(jié)構(gòu)消失（微絨毛），細(xì)胞間接觸消失，但質(zhì)膜依然完整，有選擇透性，線粒體大而完整，核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔膨大，并逐漸與質(zhì)膜融合，染色質(zhì)固縮化，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)，沿核膜分布凋亡小體的形成：染色質(zhì)斷裂成大小不等的片段，與某些細(xì)胞器（線粒體）聚集在一起，被反折的質(zhì)膜包圍，形成凋亡小體，從外觀上看，細(xì)胞表面發(fā)泡，產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，隨后逐漸分離，形成凋亡小體。凋亡小體被臨近的細(xì)胞或體內(nèi)吞噬細(xì)胞所吞噬,殘余物質(zhì)被消化后重新利用。整個過程最大的特點(diǎn)是質(zhì)膜始終保持完整，內(nèi)含物不發(fā)生細(xì)胞外泄露，不引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

Morphologichanges:

Early:Chromosomecondensation,cellbodyshrinkLater:BlebbingandNucleusandcytoplasmfragment—ApoptoticbodiesAtlast:PhagocytosedApoptosisNecrosisDeathbyapoptosisisaneat,orderlyprocess意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物的個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用1）清除有機(jī)體不再需要的細(xì)胞，而不引起炎癥反應(yīng)。2）細(xì)胞的自然更新，清除被病原體感染的細(xì)胞3）免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊并引起死亡，也是基于細(xì)胞凋亡4）細(xì)胞凋忘失調(diào)會導(dǎo)致疾病PRIZEDHorvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)2002年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎獲得者◆2002年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎授予了在器官發(fā)育和程序性細(xì)胞死亡研究領(lǐng)域中做出奠基性貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家:●英國的SydneyBrenner、美國的H.RobertHorvitz、英國的JohnE.Sulston●他們創(chuàng)造性地用線蟲作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?實(shí)現(xiàn)了對器官發(fā)育過程中細(xì)胞分裂、分化的原位觀察,完成了細(xì)胞圖譜的繪制,●在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)并研究了調(diào)控器官發(fā)育程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵基因及其功能并進(jìn)一步在高等哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)功能基因。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.SulstonApoptosisinducedbyCytoCLane1．0h2．1h3．2h4．3h5．4h6．Control7．Marker

2.0kbp1.00.50.2180~200bpDNAladder細(xì)胞凋亡的檢測方法形態(tài)學(xué)觀測：臺盼藍(lán)、DAPI、Giemsa，DNA電泳，TUNEL測定法，彗星電泳法，流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制Earlyresearches(MIT:RobertHorrid,1986)C.

elegans:1090cells,

TheFindingofCED3mutantWithoutlosinganyoftheircellstoapoptosis.CED3geneplayacrucialroleintheprocessofapoptosis.Celegans:amillimeterlong,transparentbodyonlyafewcelltypes,fromzygotetomatureadultonlyin3.5days.131cellsdeath.線蟲體細(xì)胞凋亡研究：PCD相關(guān)基因15個，分為四組：1、與PCD有關(guān)的基因，負(fù)責(zé)PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。2、與PCD過程吞噬作用有關(guān)：ced-1、ced-2、ced-5-8和ced-10。3、核酸酶基因（nuc-1）,控制DNA降解，但非PCD所必須。4、影響特異細(xì)胞類型PCD的基因：ces-1、ces-2、cgl-1、和

her-1.

保守性高，在哺乳動物中有相應(yīng)同源物：

Ced-3=ICE,Ced-4=Apaf-1,Ced-9=Bcl-2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子:物理因子:射線、較溫和的溫度刺激化學(xué)及生物因子：活性氧基團(tuán)和分子、鈣離子載體、維生素K、視黃酸、細(xì)胞毒素、DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑、正常生長因子的失調(diào)及凋亡因子的處理。

Apoptosisiscarriedoutbyaproteolyticsystem—

caspase

(1)Whycalledcaspase?Activesite:CysteineCleavagesite:Asparaticacid

CysteineAsparaticacidspecificproteaseAps-Xxx天冬氨酸特異性的半光氨酸蛋白水解酶,負(fù)責(zé)選擇性的切割某些蛋白質(zhì),切割的結(jié)果是使其活化或失活,非完全降解.分為兩類,一類為凋亡的起始者,一類為凋亡的執(zhí)行者.Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡Apoptosiscanbedividedintotwophases：Activationphase：Thecellrespondsto“deathsignals”thatcommitittoundergoingself-destruction.Executionphase：

Thedeathsentenceiscarriedout.Apoptosiscellsarerecognizedbyphagocytesbecausetheycarryexposedmarkers,called“eatme”signals.Thebeststudied“eatme”signalisthepresenceofphosphatidylserinemoleculesintheouterleafletofPMofapoptoticcells(byflop-flipase).

Howtoactivatecaspases?Allcaspasesexpressedasproenzymes—ProcaspasesProcaspaseNH2-terminalprodomain:HighlyvariableLargesubunit(20kD)Smallsubunit(10kD)Howareprocaspasesactivatedtoinitiatethecaspasecascade?Theactivationistriggeredbyadaptorproteinsthatbringmultiplecopiesofspecificprocaspases.

3groupsofcaspase:1、apoptoticinitiators:caspase-2,caspase-8,caspase-9andcaspase-102、apoptoticexecutioners:caspase-3,caspase-6，caspase-7and14(morphologychange)3、inflammatorymediateors:caspase-1,andcaspase-11ProcaspasesareactivatedbybindingtoadaptorproteinsThecaspasecascadeinvolvedinapoptosisProcaspaseactivationbyproteolyticcleavage.CaspasecascadeThetargetproteinsofcaspasearethefollowing:

Morethanadozenproteinkinase,includingFAK,PKC,andRaf1.FAK–disruptcelladhesionfortheapoptoticcell.

Lamins.Cleavageoflaminsleadstothedisassemblyofthenuclearlaminaandshrinkageofthenucleus.

Proteinsrequiredforcellstructure.SuchasIF,actin,andgelsilin.Cleavageandinactivationoftheseproteinsleadtochangesincellshape.

Inducecelldisplaysignalsmarkeditforphagocytosis.

TheinhibitorofCAD(Caspase-activatedDnase,anendonuclease).CleavageofCAD

inhibitorleadtoactivationofCAD,onceactivated,CADtranslocatesfromthecytosoltothenucleusseveringDNAintofragments.

EnzymesinvolvedinDNArepair.

Whichareinactivatedbycaspasecleavage.DNArepairisahomeostaticactivitythatisinappropriateinanapoptoticcell.Caspase依賴性細(xì)胞凋亡的兩條途徑：由死亡受體起始的外源途徑：死亡配體主要是腫瘤壞死因子家族成員由線粒體起始的內(nèi)源途徑：細(xì)胞色素cMolecularpathwaysofapoptosisTwoprinciplepathwaysExtrinsicpathwayIntrinsicpathway(1)

Extrinsicpathway:FasSignalingPathwayFas(alsocalledApo-1orCD95)isamemberofthetumornecrosisfactorreceptor(TNFR)superfamily.Receptor-mediatedpathwayofapoptosisBcl-2Family(cytoplasmicfactors):Bad,Bid,andbax:promoteapoptosis;Bcl-X,Bcl-w,andBcl-2:preventapoptosis.Internalstimuli:DNAdamage,highCa2+,Oxidativestress死亡受體(TNFR)：TNF/NGF受體超家族，胞外段具有半光氨酸富集的重復(fù)區(qū)；TNFR-1和Fas的胞內(nèi)段含68Aa的死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain,DD)死亡信號(deathligands):TNF超家族（TNF,CD5/Fas…..）接頭蛋白（Adaptor）:FADD(Fasassociatedproteinwithdeathdomain)；TRADD(TNFRassociateddeathdomain);AdaptorN端的DED(deatheffectordomain):誘導(dǎo)caspase8活化。Apaf-1:

(apoptoticprotease-activatingfactor)線粒體途徑的胞質(zhì)蛋白，含3個功能域：

N端85Aa,稱CARD(caspaserecruimentdomain);ced-4同源區(qū)（320Aa）;C端，介導(dǎo)蛋白與蛋白相互作用。(2)Intrinsicpathway:MitochondrialpathwayThemitochondria-mediatedpathwayofapoptosisVarioustypesofcellularstressBcl-2family:BadorBaxtobecomeinsertedintoOMofMitReleaseofcytochromecfromI-OspaceofMit.Formamultisubunitcomplex;andCaspaseCascade,…Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡:凋亡誘導(dǎo)因子,限制性內(nèi)切核酸酶G細(xì)胞凋亡的調(diào)控細(xì)胞中存在Caspase抑制因子,能夠直接與Caspase活性分子結(jié)合,阻止對底物的切割作用細(xì)胞存活因子(有絲分裂原和生長因子)NF-kB,抗凋亡,促存活.p53,促凋亡病毒抑制凋亡（二）細(xì)胞壞死?是細(xì)胞受到急性強(qiáng)力傷害時立即出現(xiàn)的反應(yīng)。?早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。?繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。?細(xì)胞凋亡的一種替補(bǔ)方式。（三）細(xì)胞自噬個體遭遇營養(yǎng)危機(jī)時，是細(xì)胞凋亡的一種補(bǔ)充途徑二.植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡衰老（aging，senescence，senility）：又稱老化，通常指生物發(fā)育成熟后，在正常情況下隨著年齡的增加，機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性下降，結(jié)構(gòu)中心組分退行性變化，趨向死亡的不可逆的現(xiàn)象。衰老和死亡是生命的基本現(xiàn)象，衰老過程發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個體水平、細(xì)胞水平以及分子水平等不同的層次。生命要不斷的更新，種族要不斷的繁衍。而這種過程就是在生與死的矛盾中進(jìn)行的。至少從細(xì)胞水平來看，死亡是不可避免的。第二節(jié)細(xì)胞衰老（cellularaging;cellsenescence）一、早期的細(xì)胞衰老研究（細(xì)胞“不死性”觀點(diǎn)）1、100年前，魏斯曼曾提出種質(zhì)不死而體質(zhì)會衰老和死亡的學(xué)說（將原生動物的衰老除外），但原生動物的“不死性”也是不成立的，因?yàn)樾录?xì)胞中存在著老化的結(jié)構(gòu)成分。2、Carrel和Ebeling宣稱培養(yǎng)的雞心臟細(xì)胞可以無限制地生長和分裂（已連續(xù)培養(yǎng)34年）認(rèn)為細(xì)胞本身不會衰老,衰老是由于環(huán)境的影響造成的。（后來Hayflick認(rèn)為Carrel每次向培養(yǎng)基中加入的雞胚提取物中可能混有新鮮的細(xì)胞）3、20世紀(jì)40-50年代，L系小鼠細(xì)胞和Hela細(xì)胞系的建立使細(xì)胞不死性的觀點(diǎn)更加鞏固。（L系小鼠細(xì)胞和Hela細(xì)胞系是不正常的細(xì)胞）二、Hayflick界限（細(xì)胞增殖能力和壽命有限的觀點(diǎn)）60年代初，Hayflick等人的出色工作提出了細(xì)胞增殖能力和壽命有限的觀點(diǎn)，同時發(fā)現(xiàn)物種壽命和培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著確切的相互關(guān)系。Hayflick界限：細(xì)胞,至少是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定壽命的，它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限。（適用于很多種類型的細(xì)胞）1961，Hayflick&Moorhead報告：人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)只能傳代40～60次。該結(jié)果后來被其他研究者所證實(shí)。細(xì)胞的增殖能力和供體的壽命正相關(guān)：Hayflick：胎兒的肺成纖維細(xì)胞可傳50代，成人的只能傳20代。Galapagos龜：壽命175歲，傳代90-125次；小鼠：壽命：3.5歲，傳代14-28次。Goldstein：兒童早老癥（Hutchinson-GilfordSyndrome）患者的成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)只能傳代2～4次（壽命只有12-18歲）。Werner’sSyndrome患者具有類似現(xiàn)象。Werner'ssyndrome頭發(fā)灰色、細(xì)弱、鷹鉤鼻。Werner'ssyndrome(aJapanese)14歲48歲Hutchinson-Gilfordsyndromeprogeriadisease體外培養(yǎng)細(xì)胞的衰老控制決定因素在細(xì)胞內(nèi)部：Hayflick老年男性的細(xì)胞和年輕女性的細(xì)胞（間期有Barrbody)混合培養(yǎng)：年輕女性的細(xì)胞傳代次數(shù)多。（培養(yǎng)環(huán)境相同）細(xì)胞核決定了細(xì)胞衰老：Wright&Hayflick老年胞質(zhì)體＋年輕細(xì)胞核：雜交細(xì)胞分裂能力強(qiáng)；年輕胞質(zhì)體＋老年細(xì)胞核：雜交細(xì)胞分裂能力弱。三、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老1、在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生；2、衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長；3、衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老；四、細(xì)胞衰老的特征1、形態(tài)變化細(xì)胞核體積增大；核膜內(nèi)折；染色質(zhì)固縮化rER減少（尼氏體消失）線粒體數(shù)量減少，體積增大

致密體densebody積累又叫脂褐質(zhì)、老年色素、殘體、血褐質(zhì)等。來自溶酶體和線粒體膜系統(tǒng)：流動性下降，常處于凝膠相或固相。間隙連接減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小。2、分子水平的變化衰老細(xì)胞會出現(xiàn)脂類、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分損傷，細(xì)胞代謝能力降低五、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制（原因及假說）90年代以來，細(xì)胞衰老分子機(jī)制研究的重大進(jìn)展：單基因的突變導(dǎo)致壽命的顯著延長；端粒和端粒酶與細(xì)胞衰老關(guān)系的發(fā)現(xiàn)等。60年代起開始出現(xiàn)的一系列衰老理論：1、氧化性損傷學(xué)說（自由基理論）Harman50年代（1956）提出。認(rèn)為代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（reactiveoxygenspecies,ROS）引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷的累積，引起細(xì)胞功能的多方面異常。正常細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等。根據(jù)該理論：清除ROS，就可以減緩衰老。超級表達(dá)SOD和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)基因果蠅的壽命延長了34%;將人的SOD基因轉(zhuǎn)入果蠅體內(nèi)，其壽命延長一倍。反例：將小鼠的谷胱苷肽過氧化物酶或SOD酶剔除一種，并未引起細(xì)胞衰老的加速。2、端粒與衰老Harley,1990發(fā)現(xiàn)端粒的長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說。端粒長度隨細(xì)胞衰老過程而逐漸縮短，但端粒酶卻可維持端粒的長度。

實(shí)驗(yàn)證據(jù)1：1990，Harley等人發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)端粒長度隨人的年齡增長而縮短；體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，端粒長度隨分裂次數(shù)增加而減小。實(shí)驗(yàn)證據(jù)2：1998，Wright等人，將人的端粒酶基因轉(zhuǎn)入人的2n的體細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞端粒長度增加，分裂旺盛，細(xì)胞衰老指標(biāo)的酶含量降低，細(xì)胞壽命延長20代。疑問1：1998，Carman，2n倉鼠的胚細(xì)胞，始終表達(dá)端粒酶，端粒長度恒定，但20～30代后仍進(jìn)