免疫組化與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究課件

免疫組化與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究免疫組織細(xì)胞化學(xué)（理論10學(xué)時(shí)、實(shí)驗(yàn)30學(xué)時(shí)）理論30分實(shí)驗(yàn)70分出勤率10筆記10開卷考試10實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)20實(shí)驗(yàn)結(jié)果30實(shí)驗(yàn)報(bào)告20總成績(jī)100分參考書：主要內(nèi)容第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)第三節(jié)組織細(xì)胞的處理第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色的原理和方法第五節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用組織學(xué):體內(nèi)結(jié)構(gòu)為立體的，三維的，而課本、講義和顯微鏡下的結(jié)構(gòu)均為平面的，二維的。a.

最常用的染料是蘇木素(Hematoxylin,H)和伊紅(Eosin,E)。*蘇木素是堿性染料，藍(lán)紫色，可以使細(xì)胞核等著色。被蘇木素著色的結(jié)構(gòu)本身為酸性，具有嗜堿性(Basophilic)。石蠟切片

*伊紅是酸性染料，粉紅色。可以將大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成紅色。被伊紅著色的結(jié)構(gòu)本身為堿性，具有嗜酸性(Acidophilic)。*不易被蘇木素和伊紅著色的結(jié)構(gòu)具有嗜中性(Neutrophilic)。

肥大細(xì)胞的顆粒被甲苯銨藍(lán)(一種藍(lán)色染料)染成紫紅色b.

如果某結(jié)構(gòu)顯示的顏色和染料本身的顏色不同，該結(jié)構(gòu)具有異染性(Metachromasia)。c.

如果某結(jié)構(gòu)能將銀離子還原成銀原子，并吸附銀原子而使自身顯示棕黑色，該結(jié)構(gòu)具有嗜銀性(Argyrophilic)。

H&E染色的中等動(dòng)靜脈d.

不同的染色方法，其結(jié)果不同。醛復(fù)紅染色的中等動(dòng)靜脈網(wǎng)狀纖維具有嗜銀性，因此可以用銀鹽染色來(lái)顯示。

第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

一、組織化學(xué)（Histochemistry）

是建立在組織和細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分不同的基礎(chǔ)上，運(yùn)用染色的方法區(qū)分出胞質(zhì)、胞核和細(xì)胞外基質(zhì)，從而顯示出組織和細(xì)胞的形態(tài)。第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

通過(guò)生物化學(xué)的方法在原位產(chǎn)生不溶解的有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物，來(lái)顯示微細(xì)結(jié)構(gòu)的位置，然后用顯微鏡觀察。

一、組織化學(xué)（Histochemistry）

組織化學(xué)源于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)，又不同于這些學(xué)科。第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

一、組織化學(xué)（Histochemistry）組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)：研究形態(tài)結(jié)構(gòu)組織化學(xué)：化學(xué)組成含量，酶的存在及活性第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

組織化學(xué)源于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)，又不同于這些學(xué)科。

一、組織化學(xué)（Histochemistry）第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義生物化學(xué)：破壞細(xì)胞，定位性差組織化學(xué)：原位顯示，定位性強(qiáng)

組織化學(xué)源于組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)，又不同于這些學(xué)科。

組織化學(xué)二、免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義免疫學(xué)免疫組織化學(xué)

立足于組織和細(xì)胞內(nèi)的某些化學(xué)物質(zhì)或結(jié)構(gòu)成分能夠作為抗原，用相應(yīng)的特異性抗體孵育組織切片，抗體與切片中的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，在顯微鏡下觀察此復(fù)合物存在的位置和數(shù)量，確定出抗原在組織和細(xì)胞中的定位和定量。二、免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

二、免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義抗原抗原抗體復(fù)合物鏡檢標(biāo)記的特異性抗體

定義：免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)。它是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)的技術(shù)。二、免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義三、免疫組織化學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義—1941年Coons

實(shí)用免疫熒光技術(shù)?！?0年代Nakane建立酶標(biāo)抗體技術(shù)?！?981年Hsu建立了ABC法?！?0年代分子雜交、原位雜交、原位PCR法迅速發(fā)展—2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，成為生命科學(xué)工作者必須掌握的基本技術(shù)之一。Acell-labelingtechniquecalledDiOlistics,inventedbypostdoctoralfellowsWen-BiaoGan,PhD,andJaimeGrutzendler,PhD,andfacultymembersRachelO.L.Wong,PhD,andJeffW.Lichtman,MD,PhD--distinguishesindividualcellsinthebrainusingsevendifferentcolors.

StylonychiamytilusAZM、UM、FCStylonychiamytilusParameciumcaudatumParameciumcaudatumStylonychiamytilus四、免疫組織化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義1.特異性強(qiáng)2.靈敏度高3.定位準(zhǔn)確優(yōu)點(diǎn)

組織細(xì)胞內(nèi)具有抗原性的物質(zhì)，如肽類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、表面抗原等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，在基礎(chǔ)與臨床科研中廣泛應(yīng)用。四、免疫組織化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義

第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)

一、抗原（antigen，Ag）第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)1.抗原的定義能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)2.抗原的兩種特性:

①免疫原性

----能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體

②免疫反應(yīng)性----可與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合

二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)1.抗體的定義：是機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下形成的一類能與抗原特異性地結(jié)合的球蛋白，稱免疫球蛋白。

二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)2.抗體的標(biāo)記：必要性：組織細(xì)胞內(nèi)Ag—Ab結(jié)合反應(yīng)一般是不可見的，若在鏡下檢測(cè)，必須具有可視性標(biāo)記物。標(biāo)記物：熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金和放射性同位素等

2.抗體的標(biāo)記：①熒光素標(biāo)記：

在抗體上標(biāo)記熒光素，經(jīng)特定波長(zhǎng)的光照射激發(fā)后能夠發(fā)出熒光，借此定位觀察和追蹤。最常用：異硫氰酸熒光素

(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)，紫外線激發(fā)下產(chǎn)生翠綠色熒光。

2.抗體的標(biāo)記：②酶標(biāo)記：

以酶作為標(biāo)記物與外加的底物作用產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原抗體反應(yīng)的部位。常用：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）

生物素2.抗體的標(biāo)記：③生物素標(biāo)記：生物素：又稱維生素H，一種小分子維生素抗生物素：又稱卵白素或親和素，對(duì)生物素具很強(qiáng)的結(jié)合力。兩者即可與抗體偶聯(lián)，又可被酶標(biāo)記生物素抗生物素

生物素---抗生物素系統(tǒng)一端偶聯(lián)大分子生物反應(yīng)體系，另一端連結(jié)標(biāo)記物，后者加入酶的底物，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

去除抗體溶液中不需要的雜有成分，提高標(biāo)記抗體的特異性，減少背景染色。二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)3.標(biāo)記抗體的純化：

4.標(biāo)記抗體的質(zhì)量評(píng)估和保存：

目前我們?cè)囼?yàn)所用的抗體大多由試劑公司（SIGMA、SANTA等）直接購(gòu)買第三節(jié)組織細(xì)胞的處理第三節(jié)組織細(xì)胞的處理?標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件?免疫組化對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求：–保持標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)；–在原位保持待測(cè)抗原的免疫活性；–根據(jù)抗原含量及特性選擇最佳實(shí)驗(yàn)方法。

一、取材二、固定三、脫水四、透明第三節(jié)組織細(xì)胞的處理五、透入與包埋六、切片七、貼片與烤片

免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本第三節(jié)組織細(xì)胞的處理?細(xì)胞標(biāo)本組織印片細(xì)胞培養(yǎng)片細(xì)胞懸液涂片石蠟切片冰凍切片?組織標(biāo)本一、取材

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材將潔凈載玻片輕壓于已暴露的新鮮組織切面，細(xì)胞即粘附于玻片，晾干后固定，自然干燥后染片或-20℃保存。①組織印片（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材p53免疫組化結(jié)果,胃熱傷陰型,腺癌II級(jí),+++,×100

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)，達(dá)適當(dāng)密度后取出固定，再染色。②細(xì)胞培養(yǎng)片（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理探討是否能夠從低溫保存的流產(chǎn)兒分離培養(yǎng)出脊髓神經(jīng)干細(xì)胞

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材–手涂法

?將細(xì)胞直接涂于載玻片上，均勻不重疊。–涂片機(jī)涂片法

?將細(xì)胞樣品制成細(xì)胞懸液，加入涂片機(jī)內(nèi)離心。③細(xì)胞懸液涂片（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材③細(xì)胞懸液涂片（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材海馬神經(jīng)元內(nèi)11β-HSD1與GR的免疫細(xì)胞化學(xué)染色GC可以促進(jìn)海馬神經(jīng)元11β-HSD1的表達(dá),此作用是否與GR介導(dǎo)的基因機(jī)制有關(guān)糖皮質(zhì)激素代謝酶11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型(11β-HSD1)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)在大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)的共同分布及其意義。用免疫細(xì)胞化學(xué)方法研究顯示,海馬神經(jīng)元內(nèi)不僅存在11β-HSD1免疫反應(yīng)物質(zhì),還存在GR免疫反應(yīng)物質(zhì),而且11β-HSD1與GR共存于同一個(gè)海馬神經(jīng)元內(nèi)

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材1.動(dòng)物處死的要求：迅速處死，避免因痛苦產(chǎn)生組織細(xì)胞的變形2.動(dòng)物處死的方法麻醉（乙醚、氯仿、4%戊巴比妥、20%氨基甲酸乙脂）擊頭、頸椎脫臼、毀腦和脊髓股動(dòng)脈放血、空氣栓塞法（二）組織標(biāo)本的取材

3.取材的注意事項(xiàng)（二）組織標(biāo)本的取材1）處死后立即取材。2）刀片鋒利，維持原形。3）取材力求小而薄。4）詳細(xì)記錄材料名稱及取材時(shí)間。第三節(jié)組織細(xì)胞的處理一、取材

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理二、固定（一）固定的目的1.終止酶的活性，防止自溶。2.維持原有形態(tài)。3.硬化組織，便于切片。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理二、固定（二）固定的注意事項(xiàng)1.取材后迅速固定2.選取適宜的固定劑3.固定液的用量（固定液：材料=20：1）4.固定的時(shí)間（取決于組織塊的大小、部位、固定液的滲透力及溫度）5.鉛筆做標(biāo)簽（材料名稱、固定液及時(shí)間）

（三）理想的固定劑需具備的條件：1.迅速滲入材料。2.使細(xì)胞不致因固定引起人為的改變。3.對(duì)組織各部分滲透力相等，使組織內(nèi)外完全固定。4.盡可能避免組織膨脹或收縮。5.增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光程度和染色能力。6.使組織變硬，適于切片，但又不至于太硬而松散。7.固定以后又有保存作用。

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：固定濃度：固定時(shí)間：固定后處理：配制方法：特性：滲透力強(qiáng)，組織收縮少。易氧化10%水溶液12-24h流水沖洗12-24h甲醛原液10-20ml+蒸餾水90-80ml1.甲醛

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：固定濃度：固定時(shí)間：固定后處理：配制方法：特性：兼有硬化和脫水作用。很少單獨(dú)使用。80--95%乙醇取決于組織大小及乙醇濃度4-12h直接入脫水劑無(wú)水乙醇80-90ml+蒸餾水10-20ml2.乙醇（酒精）

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：配制方法：固定時(shí)間：固定后處理：無(wú)水乙醇或95%乙醇（A）90ml+甲醛原液（F）10ml組織塊4-12h，鋪片5-10min直接入脫水劑脫水3.A-F液（乙醇-甲醛溶液）

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：配制方法：固定時(shí)間：固定后處理：飽和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰乙酸5ml12-24h70%酒精洗去苦味酸的黃色4.Bouin液

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：配制方法：固定時(shí)間：固定后處理：冰乙酸10ml+氯仿30ml+無(wú)水乙醇60ml20-40min，較大材料不超過(guò)2-4h直接入脫水劑脫水5.Carony液

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：6.戊二醛-多聚甲醛緩沖液配制方法：固定后處理：應(yīng)用：4%多聚甲醛磷酸緩沖液中加入0.5-1%戊二醛磷酸緩沖液水洗免疫電鏡

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：7.升汞固定濃度：固定時(shí)間：固定后處理：特性：5-7%水溶液不超過(guò)24h碘酒溶液脫汞劇毒

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點(diǎn)：水溶液中性，淡黃色結(jié)晶固定蛋白質(zhì)均勻，不使細(xì)胞收縮對(duì)胞質(zhì)固定很好，而核則固定不好。優(yōu)點(diǎn)：穿透速度慢，可保持組織柔軟，防止硬化缺點(diǎn)：固定不均勻，表面過(guò)度以致于難于染色。深部沒(méi)有固定，僅中部才適宜。有毒。8.鋨酸（四氧化鋨）1-2%雙蒸水溶液

（五）固定的方法：1．浸入法：將組織浸在固定液內(nèi)，必要時(shí)可在低溫（4℃）環(huán)境下進(jìn)行，固定時(shí)間根據(jù)抗原的穩(wěn)定性以及固定液性質(zhì)而定，一般2-12h之間。2．灌注法：適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。自左心室插入主動(dòng)脈，先以生理鹽水沖冼血液后，注入固定液。置灌注動(dòng)物于4℃冰箱內(nèi)，次日取出腦組織或其它組織。外周組織一般在灌注后30min內(nèi)取材，取組織置同一固定劑中浸入1-3h。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理三、脫水（一）脫水的目的

組織經(jīng)固定及水洗后含有大量水分，因水不能與石蠟混合，故需用脫水劑將組織中的水分置換出來(lái)。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理三、脫水（二）脫水劑類型常用：酒精、丙酮等。必須是與水在任何比例下都可混合的液體

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理三、脫水（三）酒精脫水的注意事項(xiàng)1.逐級(jí)脫水（50%、70%、85%、95%、100%、100%）2.為徹底脫水走兩次純酒精3.70%酒精可長(zhǎng)期保存材料4.脫水時(shí)間適宜。低濃度酒精中不宜過(guò)久，否則變軟，甚至促進(jìn)分解。高濃度酒精中也不宜過(guò)久，否則收縮、變脆，切片困難。5.低溫脫水

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理四、透明（一）透明的目的

共有兩次透明過(guò)程：

1.在浸蠟前、脫水后的透明過(guò)程。將脫水劑換成透明劑而有利于石蠟浸入。

2.切片染色后脫水再次透明。有利于封固劑的透入。使光線均勻透過(guò)切片，有利于觀察。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理四、透明（二）常用的透明劑1.二甲苯：最常用的透明劑，溶于酒精和石蠟。能與封固劑樹膠混合。透明力強(qiáng)，作用較快。

缺點(diǎn)：易使組織收縮變脆，此步不可久留，略帶酸性，略有褪色作用。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理四、透明（二）常用的透明劑二甲苯透明過(guò)程：100%酒精脫水后

1/2二甲苯+1/2純酒精

純二甲苯用二甲苯完全置換出酒精

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理四、透明（二）常用的透明劑2.氯仿優(yōu)點(diǎn)：毒性低，材料收縮不太強(qiáng)烈，易揮發(fā)。缺點(diǎn)：能破壞染色。滲透力稍弱，需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，比重大，易使材料漂浮第三節(jié)組織細(xì)胞的處理五、透入與包埋（一）透入的目的

除去組織中的透明劑而代之以石蠟，使石蠟滲入組織內(nèi)部后把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，以便切成薄片。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理五、透入與包埋（二）透入包埋劑（石蠟）60~62℃時(shí)，用液態(tài)石蠟完全置換出二甲苯。室溫時(shí)石蠟?zāi)坛晒虘B(tài)，內(nèi)含待切組織。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理五、透入與包埋（二）透入包埋劑（石蠟）室溫切片厚度3-5um5-8um8-10um10-15um石蠟熔點(diǎn)17-21℃60℃57℃54℃52℃22-24℃64℃60℃60℃57℃25-28℃67℃65℃62℃60℃（三）浸蠟與包埋過(guò)程中的注意事項(xiàng)石蠟太硬切片時(shí)容易破碎，不易切成蠟帶；石蠟太軟則使蠟帶皺縮，貼片時(shí)很難排平。2.新蠟使用前應(yīng)先在浸蠟箱中融化，趕走氣泡，舊蠟可重復(fù)利用，效果比新蠟好。3.包埋時(shí)注意材料的方向性4.帶二甲苯的舊蠟統(tǒng)一回收，不帶二甲苯的舊蠟回收后再利用。5.不用燙鑷子夾材料，防止蠟帶帶靜電。6.做好標(biāo)簽。第三節(jié)組織細(xì)胞的處理六、切片（一）切片機(jī)

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理六、切片1.切片平整2.連續(xù)切片3.貼片牢固4.根據(jù)研究目的，調(diào)整切片厚度。

（二）切片的注意事項(xiàng)

1.蠟帶不直：修蠟塊時(shí)不平行2.不能切成連續(xù)蠟帶：切片刀不鋒利或刀口與蠟塊的角度不適合。3.蠟帶皺縮：石蠟太軟或切片時(shí)室溫過(guò)高，可用冷水浸蠟塊。切片太薄。刀口與蠟塊角度<15o4.蠟帶有靜電不成帶：包埋時(shí)溫度高燙了材料，不易糾正5.蠟帶翻上不成帶：石蠟硬，刀角不適當(dāng)。6.盛蠟帶的紙盤一定要干凈。（三）切片時(shí)常見技術(shù)問(wèn)題的處理

新載玻片清洗法：熱洗衣粉水洗自來(lái)水沖洗蒸餾水鹽酸酒精過(guò)夜自來(lái)水沖洗蒸餾水70%酒精擦凈裝盒備用第三節(jié)組織細(xì)胞的處理七、貼片與烤片（一）載玻片、蓋玻片的清洗鹽酸酒精的配制：95%酒精9份+濃鹽酸1份

舊載玻片清洗法：洗衣粉水煮沸20-30分鐘，攪動(dòng)去掉蓋玻片，每片洗凈再按上述方法進(jìn)行。第三節(jié)組織細(xì)胞的處理七、貼片與烤片（一）載玻片、蓋玻片的清洗

蓋玻片清洗法；逐片投入到95%酒精中浸泡過(guò)夜擦凈備用。

第三節(jié)組織細(xì)胞的處理七、貼片與烤片（二）常用的貼片劑APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）鉻明膠溶液

石蠟組織切片中抗原性的修復(fù)

#抗原修復(fù)的原因

前期處理過(guò)程使蛋白大分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，從而屏蔽抗原決定簇或使其三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變。染色時(shí)需先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。

石蠟組織切片中抗原性的修復(fù)

修復(fù)的方式：胰蛋白酶微波照射高壓加熱法水浴加熱法第四節(jié)免疫組化染色的原理及方法

按抗體標(biāo)記物的性質(zhì)分成：①免疫熒光法②免疫酶法③親合免疫組化等

免疫組織化學(xué)的技術(shù)分類

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法常用的標(biāo)記熒光素：一、免疫熒光法熒光素激發(fā)光波長(zhǎng)顏色FITC450-490nm翠綠色TRITC530-560nm紅色RB200570nm橙色

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法1.直接法

抗原+熒光素標(biāo)記的第一抗體→熒光顯微鏡檢測(cè)簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，靈敏度低應(yīng)用：基本不用了??！一、免疫熒光法抗原抗體熒光素

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.間接法

一、免疫熒光法抗原+第一抗體+熒光素標(biāo)記的第二抗體→鏡檢2.間接法抗原2.間接法一抗抗原因信號(hào)被放大，因此更加敏感。應(yīng)用：常用2.間接法一抗抗原熒光素標(biāo)記的二抗

例：一、免疫熒光法

人催乳素兔注入產(chǎn)生兔抗人催乳素抗體（一抗）羊抗兔抗體（二抗）間接法的標(biāo)記抗體適用范圍廣

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡（倒置）激光掃描共聚焦顯微鏡

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法一、免疫熒光法直接法間接法

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法二、免疫酶法

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法原理：以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用產(chǎn)生不溶性的色素，沉積于抗原抗體反應(yīng)部位。應(yīng)用較廣二、免疫酶法

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法二、免疫酶法（一）酶標(biāo)記抗體法（酶標(biāo)法）

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法抗原+HRP酶標(biāo)抗體→抗原-抗體-HRP復(fù)合物二、免疫酶法1.直接法（一）酶標(biāo)記抗體法（酶標(biāo)法）

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法抗原-抗體-HRP復(fù)合物+底物與顯色劑二、免疫酶法1.直接法（一）酶標(biāo)記抗體法（酶標(biāo)法）（

DAB-H2O2）DABHRP+H2O2HRP.H2O2HRP+D+H2O（有色）（供氫體）（底物）（酶）（酶-底物復(fù)合物）簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，靈敏度低，少用！

色第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法抗原+第一抗體+酶標(biāo)第二抗體+(DAB-H2O2)二、免疫酶法2.間接法（常用）（一）酶標(biāo)記抗體法（酶標(biāo)法）

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法二、免疫酶法（二）非標(biāo)記抗體酶法抗酶抗體酶HRP動(dòng)物免疫產(chǎn)生

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法二、免疫酶法1.酶橋法（二）非標(biāo)記抗體酶法抗酶抗體酶HRP動(dòng)物免疫產(chǎn)生橋抗體

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法抗原+抗體+二抗(橋抗體)+抗酶抗體+HRP+(DAB-H2O2)二、免疫酶法1.酶橋法（三抗）（二）非標(biāo)記抗體酶法

色→有色產(chǎn)物第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法抗原+抗體+二抗(橋抗體)+抗酶抗體+HRP+(DAB-H2O2)二、免疫酶法1.酶橋法（三抗）

抗體未經(jīng)酶標(biāo)記三抗對(duì)抗原具有二次放大作用，比間接法敏感。（二）非標(biāo)記抗體酶法

2.PAP法（酶-抗酶免疫復(fù)合物法）：

(Peroxidase-anti-peroxidasecomplex)

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法二、免疫酶法（二）非標(biāo)記抗體酶法抗HRP抗體HRPPAP復(fù)合物PAP復(fù)合物穩(wěn)定，不易脫落，靈敏度高。

PAP法反應(yīng)原理：抗原+一抗+二抗+PAP復(fù)合物+DAB-H2O2顯色液DAB-H2O2PAP復(fù)合物二抗

生物素第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法三、親合免疫組化生物素抗生物素（親合素、卵白素）兩者能和酶、抗體結(jié)合

生物素第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法三、親合免疫組化LAB法（標(biāo)記抗生物素-生物素法）

(Labelledavidin-biotinmethod)用酶標(biāo)記抗生物素

用生物素標(biāo)記抗體LAB法反應(yīng)原理：

抗原+一抗+生物素標(biāo)記的二抗+酶標(biāo)抗生物素+DAB-H2O2顯色液靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)潔。DAB-H2O2

生物素第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法三、親合免疫組化BAB法（橋連抗生物素-生物素法）

(Bridgedavidin-biotinmethod)用酶標(biāo)記生物素

用生物素標(biāo)記抗體BAB法反應(yīng)原理：

抗原+一抗+生物素標(biāo)記的二抗+抗生物素+酶標(biāo)生物素+DAB-H2O2顯色液

生物素第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法三、親合免疫組化ABC法（抗生物素-生物素-酶復(fù)合物法）

(Avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod)ABC復(fù)合物：生物素+酶+抗生物素生物素酶抗生物素ABC法反應(yīng)原理：

抗原+一抗+生物素標(biāo)記的二抗+ABC復(fù)合物+DAB-H2O2顯色液靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)潔。ABC復(fù)合物DAB-H2O2

四、雙重或多重免疫組化

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法

在同一標(biāo)本上同時(shí)或先后顯示兩種或兩種以上的抗原，光鏡下根據(jù)不同顏色判斷不同的抗原成分。1.雙重?zé)晒馊旧?.雙重酶染色

五、非特異性著色

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法

染色過(guò)程中產(chǎn)生的非靶抗原的著色結(jié)果，屬假陽(yáng)性，又稱背景著色。應(yīng)盡量減少或消除。

六、對(duì)照的設(shè)置

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法1.陽(yáng)性對(duì)照：用已知抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行染色。對(duì)照片結(jié)果呈陽(yáng)性。六、對(duì)照的設(shè)置

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.陰性對(duì)照：陰性標(biāo)本對(duì)照：用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，結(jié)果呈陰性。六、對(duì)照的設(shè)置

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.陰性對(duì)照：空白對(duì)照：用緩沖液取代第一抗體進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果為陰性。六、對(duì)照的設(shè)置

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.陰性對(duì)照：吸收試驗(yàn)：特異性第一抗體用相應(yīng)的純化抗原中和吸收，其結(jié)合位點(diǎn)全部被外源性抗原結(jié)合，不能再與組織內(nèi)的靶抗原反應(yīng)，用這種吸收后的第一抗體做免疫染色，結(jié)果為陰性。六、對(duì)照的設(shè)置

第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.陰性對(duì)照：抑制試驗(yàn)：用未標(biāo)記抗體與標(biāo)記抗體先后與標(biāo)本反應(yīng)，未標(biāo)記抗體起到封閉抗原的作用。染色結(jié)果減弱或轉(zhuǎn)陰。

3.染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果分析表第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照替代對(duì)照實(shí)驗(yàn)組結(jié)論1----操作錯(cuò)誤2++++非特異性反應(yīng)3+--+受檢組織含定位抗原4+---受檢組織不含定位抗原六、對(duì)照的設(shè)置

1.全部切片均為陰性的原因：①染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③底物中所加H2O2量少或失效；七、染色失敗的幾種原因第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法

七、染色失敗的幾種原因第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色原理和方法2.全部切片均為陽(yáng)性的原因：①染色過(guò)程中抗體過(guò)濃，或切片干燥了。②緩沖液洗滌不徹底。③使用已變色的顯色底物溶液，或顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。④抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。⑤H2O2

濃度過(guò)高，呈色速度過(guò)快。

以石蠟切片為例寫出組織細(xì)胞處理的過(guò)程主要內(nèi)容第一節(jié)免疫組織化學(xué)的定義第二節(jié)免疫組織化學(xué)中的免疫化學(xué)第三節(jié)組織細(xì)胞的處理第四節(jié)免疫組織化學(xué)染色的原理和方法第五節(jié)免疫組織化學(xué)的實(shí)際應(yīng)用

第五節(jié)免疫組織化學(xué)的實(shí)際應(yīng)用

第五節(jié)免疫組織化學(xué)的實(shí)際應(yīng)用題目：家雞消化道內(nèi)5-HT細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位

家雞消化道內(nèi)5-HT細(xì)胞的免疫組織化學(xué)定位實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)家雞消化道5-HT細(xì)胞進(jìn)行鑒定和定位研究。實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)方法：結(jié)果：討論：3.實(shí)驗(yàn)方法3.1石蠟切片的制備3.1.1.取材：①用繩系于家雞頸部，窒息死亡。3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.1取材：②剖開體腔3.1.1.取材：

③取消化道各段：食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、空回腸、盲腸和直腸。取材大?。?.5cm3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.2.固定：

用生理鹽水洗凈后，投入改良的Bouin’s液中固定12-24h過(guò)夜。3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.3.保存：

將固定液倒出，固定后的組織用70%酒精洗2次?？稍?0%酒精中暫時(shí)保存。3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.4.脫水：梯度酒精脫水80%乙醇3h90%乙醇3h95%乙醇I2h95%乙醇II2h無(wú)水乙醇I2h無(wú)水乙醇II2h

3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.5.透明：

1/2無(wú)水乙醇+1/2二甲苯2h（可過(guò)夜）二甲苯I2h

二甲苯II2h

3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.6.浸蠟：選取熔點(diǎn)為60℃的石蠟首先在60℃條件下熔解石蠟烘箱

3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.6.浸蠟：在60℃條件下進(jìn)行1/2二甲苯+1/2石蠟2h純石蠟I2h純石蠟II2h

3.實(shí)驗(yàn)方法3.1.7.包埋：將液體石蠟倒入包埋筐內(nèi)，放入標(biāo)簽，貼著筐壁，字向外，用酒精燈加熱鑷子，用鑷子攪動(dòng)筐中央稍有些凝固的石蠟，將材料放入筐中央部位。室溫下凝固變硬成蠟塊

3.1.8.切片：把包埋好的蠟塊用刀片修切成正方形或長(zhǎng)方形，注意勿太靠近組織，讓組織四周留有少許石蠟。蠟塊兩邊必須切成平行的直線，以免切下的蠟條彎曲。

3.1.8.切片：將上表面放有碎石蠟的手術(shù)刀在酒精燈上加熱。將熔好的蠟液涂在木塊上表面。再次加熱刀片，將刀片放于木塊與蠟塊之間，使蠟塊下表面及木塊上表面的蠟熔化后，迅速抽出刀片，蠟塊即粘于木塊上。用加熱的刀片將蠟塊與木塊接觸的四個(gè)邊緣稍熔，用手指按壓以加固。

3.1.8.切片：

將刀和木塊固定在切片機(jī)上。調(diào)整刻度指針到要求的厚度，一般要求5—8微米。切片刀要拭凈。用右手搖切片機(jī)轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆托住蠟帶。勻速轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪。均勻切片。切好的蠟帶，放在切片盒內(nèi)（或紙上）。

用刀片將其每4-5片分成一段。用無(wú)水乙醇將展片臺(tái)擦凈，使溫度保持在比包埋石蠟的熔點(diǎn)低5-6℃，如包埋石蠟的熔點(diǎn)為60℃，則展片臺(tái)宜在55℃左右。溫度過(guò)低，展片費(fèi)時(shí)過(guò)長(zhǎng)；溫度過(guò)高，石蠟熔化。切好的蠟帶切片盒3.1.9.貼片、展片：在預(yù)先用明膠處理過(guò)的載玻片一端滴二滴經(jīng)煮沸去氣泡的蒸餾水。用小鑷子夾取一段蠟帶，使浮在玻片的水上，擺正位置（一般稍偏于玻片的一端，留下貼標(biāo)簽位置）。然后把玻片放在展片臺(tái)上，蠟帶受熱即自動(dòng)展開，也可用解剖針輕輕拉開。傾斜載片，用吸水紙吸去多余水分。注意切片和載玻片之間不能有氣泡，否則在展片時(shí)氣泡會(huì)擴(kuò)大，影響以后鏡檢。

3.1.9.貼片、展片：標(biāo)簽37℃展片臺(tái)上烘片24h以上將片子移入載片盒，放入37℃恒溫箱內(nèi)24h。處理好的片子放入4℃冰箱中備用?？杀４?-2個(gè)月

3.1.9.貼片、展片：標(biāo)簽

標(biāo)簽標(biāo)簽

3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.1.脫蠟、復(fù)水：二甲苯I二甲苯II1/2二甲苯+1/2無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇I無(wú)水乙醇II95%乙醇I95%乙醇II90%乙醇80%乙醇70%乙醇雙蒸水I雙蒸水II3.2免疫組織化學(xué)染色：每級(jí)各3~5min

每級(jí)各3~5min。二甲苯I

二甲苯II

1/2二甲苯+1/2無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇I無(wú)水乙醇II95%乙醇I95%乙醇II90%乙醇80%乙醇70%乙醇雙蒸水I雙蒸水II3.2.1.脫蠟、復(fù)水：

3.2.2.用蠟筆在載片上畫蠟圈3.2免疫組織化學(xué)染色：標(biāo)簽

3.2.3.加3%H2O2溶液37℃孵育15min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.4.雙蒸餾水浸洗5min，PBS浸洗5min。雙蒸餾水PBS3.2免疫組織化學(xué)染色：

以下步驟均在濕盒中進(jìn)行：3.2.5.從PBS中取出切片，用濾紙吸去多余水分后，滴加正常羊血清（3：200），放入孵育濕盒內(nèi)，室溫孵育20min。標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.6.棄去多余血清，滴加1：100稀釋的第一抗體，放入孵育濕盒內(nèi)，室溫過(guò)夜。標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

PBS3.2.7.PBS沖洗3次，每次5min。3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.8.滴加1：200生物素化二抗，放入孵育濕盒內(nèi)，室溫孵育45min標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

PBS3.2.9.PBS沖洗3次，每次5min。3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.10.用前30min，按一定比例混合A液（親和素）和B液（酶標(biāo)生物素）形成親和素—生物素亞飽合復(fù)合物（稀釋倍數(shù)1：1：100），室溫孵育40min。標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

PBS3.2.11.PBS沖洗3次，每次5min。其間配制DAB-H2O2顯色液（2.5mlDAB，加1μlH2O2）3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.12.DAB-H2O2顯色，冷蒸餾水沖洗、PBS沖洗，自來(lái)水洗凈。顯色應(yīng)注意溫度與時(shí)間的關(guān)系，室溫宜5分鐘。染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.13.用蘇木精復(fù)染標(biāo)簽3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.14.脫水、透明70%乙醇80%乙醇90%乙醇100%乙醇I100%乙醇II二甲苯I二甲苯II每級(jí)1min3.2免疫組織化學(xué)染色：

3.2.15.封片：加中性樹膠封片3.2免疫組織化學(xué)染色：

第一抗體由PBS取代同步進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)。3.3對(duì)照設(shè)置：2.實(shí)驗(yàn)材料成體家雞2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2.2主要試劑2.實(shí)驗(yàn)材料一抗：5-HT抗體北京中山生物技術(shù)有限公司VECTASTAINABC免疫組織化學(xué)試劑盒：包括正常血清、試劑A、試劑B和二抗，由美國(guó)ZYMED公司生產(chǎn)。

氯化鈉、苦味酸、甲醛（36%）、乙醇、二甲苯、石蠟、硫酸鉻鉀、明膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、Tris、30%過(guò)氧化氫、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、鹽酸、氫氧化鈉,蘇木精，高錳酸鉀，鉀礬。2.3其它試劑2.實(shí)驗(yàn)材料

LEICA組織切片機(jī)展片臺(tái)電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱電子天平酸度計(jì)移液器LEICA顯微鏡2.4儀器設(shè)備2.實(shí)驗(yàn)材料

2.5試劑配制與用具準(zhǔn)備2.實(shí)驗(yàn)材料①改良的Bouin,s固定劑的配制苦味酸飽和水溶液75ml

福爾馬林（36%甲醛）25ml

②粘片劑：鉻礬明膠液鉻礬（硫酸鉻鉀）0.5g

明膠5g

蒸餾水1000ml2.5試劑配制與用具準(zhǔn)備2.實(shí)驗(yàn)材料

在1000ml的燒杯中，加入500-800