干擾素效價(jià)測(cè)定（細(xì)胞病變抑制法）

干擾素效價(jià)測(cè)定（細(xì)胞病變抑制法）干擾素效價(jià)測(cè)定（細(xì)胞病變抑制法）北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司1試驗(yàn)材料所用試劑均需分析純或與指定產(chǎn)品相當(dāng)。1.1MEM培養(yǎng)液按說(shuō)明書(shū)配制，經(jīng)除菌過(guò)濾，置于玻璃或塑料瓶中，4C保存。使用期限不得超過(guò)產(chǎn)品標(biāo)示有效期。1.2牛血清應(yīng)符合《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中牛血清的有關(guān)要求。1.3完全培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加10%牛血清。1.4測(cè)定培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加7%牛血清。1.5攻毒培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液添加3%牛血清。1.6消化液取0.2g乙二胺四乙酸二鈉、8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、1.152g磷酸氫二鈉、0.2g磷酸二氫鉀，用蒸餾水配成1000ml的溶液，經(jīng)121C、15分鐘高壓滅菌。1.7染色液取50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸餾水定容至100ml。1.8脫色液50%乙醇，50%蒸餾水，0.1%乙酸（ml/ml）。1.9標(biāo)準(zhǔn)品干擾素效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。PBS取8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、1.44g磷酸氫二鈉、0.24g磷酸二氫鉀用蒸餾水配成1000ml的溶液，經(jīng)12UC、15分鐘高壓滅菌。WISH細(xì)胞（人羊膜細(xì)胞）WISH細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈單層，貼壁生長(zhǎng)，每周2次，1：4消化傳代，于完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。VSV（水泡性口炎病毒）-70C保存。2試驗(yàn)步驟2.1?2.7項(xiàng)各步驟應(yīng)于無(wú)菌條件下進(jìn)行。2.1鋪板棄去WISH細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗2次后消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成2.5x105?3.5x105個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100plo37C,5%CO2條件下培養(yǎng)4?6小時(shí)。2.2制備標(biāo)準(zhǔn)溶液取1支標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明書(shū)溶解后，用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至103IU/mlo2.3制備樣品溶液將待檢樣品按說(shuō)明書(shū)溶解后，用測(cè)定培養(yǎng)液稀釋至103IU/mlo2.4于96孑L細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1505測(cè)定培養(yǎng)液。在A6、A7各孔中每孔加入50pl標(biāo)準(zhǔn)溶液，在A2、A3;A4、A5;A8、A9;A10、A11各孔中每孔加入505各待檢樣品溶液，每個(gè)待檢樣品做2個(gè)復(fù)孔。自A行取505至H行作4倍稀釋?zhuān)靠琢?505余液。2.5加樣取2.1項(xiàng)制備的細(xì)胞培養(yǎng)板。將2.4項(xiàng)制備的溶液移入該細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100plo37C,5%CO2條件下培養(yǎng)18?24小時(shí)。2.6制備病毒液攻毒劑量為100TCID50，取保存的VSV用攻毒培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。2.7攻毒取2.5項(xiàng)制備的細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清。加入病毒液，每孔1005。37C,5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)（鏡檢標(biāo)準(zhǔn)溶液的50%病變?cè)贒或E行）。2.8染色棄去上清，每孔加入50口1染色液，室溫方攵置30分鐘。2.9脫色流水小心沖去染色液，吸干殘留水分。每孔加入1005脫色液，室溫放置3?5分鐘。2.10比色測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm，記錄測(cè)定結(jié)果。3結(jié)果計(jì)算采用計(jì)算機(jī)程序或直線(xiàn)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理。分別計(jì)算各試驗(yàn)樣品的半效稀釋倍數(shù)（即從樣品溶液至相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品50%最大效應(yīng)點(diǎn)的