海洋生物體中金剛烷胺的測定-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法編制說明

《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-(一)任務(wù)來源2019年9月4日，山東省市場監(jiān)督管理局印發(fā)《關(guān)于印發(fā)2019年度標準化綜合改革暨山東標準建設(shè)項目計劃的通知》(魯標改辦發(fā)(2019)6號),將《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》列入山東省地方標準制修訂計劃，項目編號為16,由山東省海洋局提出，山東省海洋標準化技術(shù)委員會(魯TC20)歸口，由山東省海洋資源(二)起草單位、起草人及任務(wù)分工本標準起草單位是山東省海洋資源與環(huán)境研究院、中國海洋大學(xué)。山東省海洋資源與環(huán)境研究院是一所擁有60余年海洋與漁業(yè)科研歷史、多學(xué)科綜合性的省屬公益性重點科研機構(gòu)。承擔(dān)國家、省部等公益性科研項目數(shù)百項，成果獲各級獎勵120余項，多項成果達國際領(lǐng)先及國際先進水平。水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心從屬山東省海洋資源與環(huán)境研究院，中心掛農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(煙臺)牌子，為山東省制訂和實施漁業(yè)法規(guī)、保障水產(chǎn)品食用安全、促進海洋和漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展，提供了強有力的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。中心先后起草了GB31660.3-2019《食品安全國家標準水產(chǎn)品中氟樂靈殘留量的測定氣相色譜法》、GB雌三醇殘留量的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部1163號公告-9-2009《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測氣相色譜-質(zhì)譜法》酰甲喹殘留量的測定液相色譜法》等近30項檢測類山東省地方標準，并參與《食品安全國家標準水產(chǎn)品中紅霉素殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》等十余項標準的驗證工作，熟悉標準制定工作。項目組主要成員均參加過全國水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會舉辦的標準培訓(xùn)班并獲得證書，主持、參田秀慧：主持調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計、標準起草和修劉小靜：參與調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計等工作；劉昕：參與調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計等工作；任傳博：參與調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計、標準起草和修張秀珍：參與調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計等工作；孫春曉：參與調(diào)查研究、標準內(nèi)容設(shè)計等工作；薛敬林：參與調(diào)查研究、標準起草和修改、實驗室分析崔艷梅：參與調(diào)查研究、實驗室分析等工作；徐英江：參與調(diào)查研究、實驗室分析等工作；宮向紅：參與調(diào)查研究、實驗室分析等工作；張華威：參與調(diào)查研究、實驗室分析等工作；(三)起草過程1.立項情況治流感病毒的常用藥。2012年11月備受關(guān)注的“速成雞”事件中，某些養(yǎng)殖企業(yè)非法使用金剛烷胺等違禁藥物所帶來的食品安全問題，引起了人們的普遍關(guān)注。2012年由于我國國內(nèi)出現(xiàn)雞肉使用抗菌劑的報道，2013年，日本厚生勞動省醫(yī)藥食品安全部為了安全起見將金剛烷胺的檢測加入到進口食品監(jiān)控計劃中?；诖?，山東省海洋資源與環(huán)境研究院提山東省海洋標準化技術(shù)委員會召開標準研討會。邀請專家對標準的申請文件進行了審閱，與會專家對申請立項的《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進行初審，審核了擬申報標準項目標準草案及編制說明，規(guī)范了標準的格式及用詞用語，對必要性進行了論證，在修訂標準的必要性、可行性等方面統(tǒng)一了認識。2019年9月4日，山東省市場監(jiān)督管理局印發(fā)《關(guān)于印發(fā)2019年度標準化綜合改革暨山東標準建設(shè)項目計劃的通知》(魯標改辦發(fā)(2019)6號),將《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色2.起草階段在接到《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標準制定任務(wù)后，成立了標準制定小組，在儀器設(shè)備、試驗材料和資料檢索等方面做了充分準備，并對所檢索到的資料進行了綜合分析，在已建立的海水中金剛烷胺殘留的測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的基礎(chǔ)上，依據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T20001.4-2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》,完成了本文件的征求意見稿，并請農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(舟山)和煙臺海關(guān)技術(shù)中心進行方法驗證試驗，匯總了驗證實驗數(shù)據(jù)。3.征求意見階段2020年1月至3月(時間符合“公開征求時間滿足至少30天”的要求),通過電子郵件和電話問詢的方式對三十家回函并有建議或意見的單位數(shù)16個。專家意見涉及征求意見稿和編制說明的主要內(nèi)容和結(jié)構(gòu)。按照意見對主要內(nèi)容進行了修訂，主要對表述和寫法進行了修改，使其符合相關(guān)規(guī)定；同時對文本的結(jié)構(gòu)進行了調(diào)整和優(yōu)化。對征求意見稿進行修改完善后，提交山東省海洋標準化服務(wù)平臺進行公示，4.送審階段2021年11月19日，山東省海洋局、山東省海洋標準化技術(shù)委員會在濟南組織召開了山東省地方標準《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》專家論證會議。會議邀請專家組成標準論證專家組，與會專家聽取了起草單位關(guān)于標準編制情況的匯報和說明，經(jīng)質(zhì)詢討論，形成專家與相關(guān)國家標準、行業(yè)標準和地方標準的相協(xié)調(diào)；文本編寫具有可靠性和可操作性，為開展海洋生物體中的金剛烷胺測定提供了技術(shù)依據(jù)。起草單位按照專家提出的意見進行修改完善，按程序進行送審，形成標準送審稿。5.審查階段2023年4月，山東省海洋局在濟南組織召開了山東省地方標準《海洋生物體中金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》專家審查會議，山東省市場監(jiān)督管理局對審查會議進行監(jiān)督指導(dǎo)。來自國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心等單位9名專家組成了審查委員會。審查委員會聽取了標準編制情況匯報，對標準文本和標準編制說明進行了逐章、逐條審查。審查委員會對標準材料提出了審查意見，標準起草工作組根據(jù)審查意見對標準進行了修改完善，審查委員會對修改內(nèi)容予以確認。會議一致同意該標準通過審查，要求起草單位盡快形成報批材料后上報山東省市場監(jiān)督管理局。標準起草工作組根據(jù)專家審查會意見，形成了本文件的報批稿，報山東省市場監(jiān)督金剛烷胺是一類由Setter于1960年首次合成，Davis于1964年首次發(fā)現(xiàn)具有抗病毒作用的抗病毒藥物，也是美國FDA首個批準的抗流感病毒藥物。根據(jù)其藥理作用，國內(nèi)現(xiàn)在主要將金剛烷胺用于雞、豬流感的預(yù)防和早期治療，以及豬傳染性胃腸炎的防治。但金剛烷胺可能產(chǎn)生嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心、食欲減退等多種不良反應(yīng)，具有一定的毒副作用。長期使用金剛烷胺可使病毒產(chǎn)生不同程度的耐藥性，誘導(dǎo)產(chǎn)生新型耐藥病毒。動物實驗也表明其對胚胎有毒為避免影響國家動物疫病強制性免疫政策落實及給重大動物疫病防控工作帶來不良后果，農(nóng)業(yè)部發(fā)布《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》,規(guī)定除經(jīng)批準生產(chǎn)、使用的疫苗產(chǎn)品外，禁止使用金剛烷胺防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。20世紀90年代后，當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)逐漸規(guī)?；?，驟增的養(yǎng)殖密度導(dǎo)致大規(guī)模疾病頻繁發(fā)生，缺乏科學(xué)知識的養(yǎng)殖商戶愚昧無知，為了滿足自身經(jīng)濟利益，在畜禽養(yǎng)殖過程中為防止動物疫病發(fā)生從而導(dǎo)致經(jīng)濟利益受到損害的情況下，不規(guī)范使用及使用國家違2014年，山東省榮成市出入境檢驗檢疫局首次在送檢的辣椒產(chǎn)品中檢出金剛烷胺。當(dāng)前金剛烷胺的檢測方法研究多是針對動物源性食品和飼料中藥物殘留量的檢測，關(guān)于海洋生物體中金剛烷胺的檢測技術(shù)尚未發(fā)布相關(guān)標準，因此建立海洋生物體中金剛烷胺的檢測方法，對保障海洋生物體的質(zhì)量安全及海洋監(jiān)管十分重要。雖然目前關(guān)于海洋生物體中金剛烷胺污染的報道較少，但是不排除濫用藥物后對海洋生物污染的可能，并且我們在前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn)某些海帶、海參等水產(chǎn)品中檢出金剛烷胺殘留，因此為保證食品和環(huán)境安全，建立海洋生物體中金剛烷胺殘留檢測方法勢在必行。山東省是藻類養(yǎng)殖大省，藻類是作為低等植物，是海洋中重要的初級生產(chǎn)者，地球上幾乎所有環(huán)境中都能見到藻類。在海洋中的多種藻類，具有豐富的資源，其中包括大型藻類和海洋藻類，其對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡起重要作用，而且與大多數(shù)污染物比魚類和貝類更為敏感。許多品種的大型海藻作為海洋經(jīng)濟藻種，其數(shù)量與質(zhì)量的變化，關(guān)系到海洋生態(tài)環(huán)境平衡與人們的食品安全。在上述背景下，在建立的行連續(xù)檢測，發(fā)現(xiàn)金剛烷胺檢出率較高。目前我國海洋生態(tài)環(huán)境整體形勢依然嚴峻，仍然處于污染排放和環(huán)境風(fēng)險的高峰期、生態(tài)退化和災(zāi)害頻發(fā)的疊加期；海洋環(huán)境監(jiān)督管理制度落實不到位，污染物標準統(tǒng)籌不夠，無法滿足海洋環(huán)境保近年來，海洋污染越來越嚴重，對海洋生物造成了較大的經(jīng)濟損失。因此建立海洋生物體中污染物的檢測技術(shù)應(yīng)迫在眉睫，以應(yīng)對保護海洋生態(tài)環(huán)境，應(yīng)完善海洋標準檢測及監(jiān)測體系的需要。目前我國及我省還沒有關(guān)于金剛烷胺在海洋環(huán)境中污染狀況的研究報道，國外也鮮有這方面的資料，其在海洋環(huán)境中分布狀況以及對海洋生物的影響都無從評保護其賴以生存的環(huán)境，提出切實可行的控制技術(shù)并對維持海洋環(huán)境的健康、可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要且已刻不容緩。(一)編制原則有關(guān)方針、政策、法律、法規(guī)，貫徹國家強制性標準；二是適用性，充分考慮我國國情，以促進海洋環(huán)境保護為目的，同時兼顧當(dāng)前及未來金剛烷胺分析技術(shù)的發(fā)展，確保為海洋有利于我國海洋環(huán)境監(jiān)測技術(shù)的進步，有利于海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與評價技術(shù)水平的提高，有利于我國海洋資源的合理開發(fā)；四是協(xié)調(diào)性，與相關(guān)國家和行業(yè)標準協(xié)調(diào)一致。(二)主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)根據(jù)金剛烷胺的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，海洋生物體樣品用1%乙酸1.標準溶液的制備與保存期限溶液制備方法參照GB/T601-2016化學(xué)試劑標準滴定溶液的制備。稱取金剛烷胺0.0100g,用乙腈溶解，并定容有效期為3個月。用乙腈稀釋金剛烷胺標準貯備液成標準使期為1個月。用乙腈稀釋成金剛烷胺內(nèi)標溶液成標準使用液，濃度為100μg/L,4℃下避光保存，有效期為1個月。保存期2.提取劑的選擇及超聲時間的選擇根據(jù)相關(guān)文獻，本實驗采用不同的提取試劑進行對比試驗，分別是乙腈、1%三氯乙酸-乙腈、3%三氯乙酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、3%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、3%乙酸-乙腈等對金剛烷胺提取，進行回收率對照實驗，添加濃度為1.0mg/L。具體步驟：準確稱取剪切后的一定量的海洋生物樣品于50mL帶螺旋蓋的聚丙烯離心管中，加入15mL提取試劑和1.0mg/L金剛烷胺內(nèi)標溶液，充分旋渦1min,20℃超聲提取20min,7000r/min離心15min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一金剛烷胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)帶有氨基，呈現(xiàn)出一定的堿性，易溶于酸性試劑，又因其屬于極性化合物，在純有機試劑中的溶解度較小，故一般文獻均選用極性較強的稀酸溶液和水-有機溶劑混合液等作為金剛烷胺的提取試劑。乙腈可以有效提取目標化合物，且具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，其提取出的弱極性成分少，在質(zhì)譜上的響應(yīng)高，基質(zhì)效應(yīng)低，因而選用乙使用1%乙酸乙腈(v/v)提取試劑的提取效果優(yōu)于其他的提取溶液，金剛烷胺的回收率高達117.75%。因此本實驗選擇1%乙酸乙腈作為提取溶液。比較了前處理超聲提取時間分別為10min、15min、20min、25min、30min五種方式對于金剛烷胺的提取效果，結(jié)果表明，隨著超聲提取時間的增加，金剛烷胺的回收率隨之增加，15min時金剛烷胺回收率達到110%左右，隨著提取時間的延長，金剛烷胺回收率穩(wěn)定在115%左右不再增加，因此，本實驗選擇超聲提取時間為15min。3.固相萃取柱的選擇由于金剛烷胺的脂溶性，脂肪較難除去。在實驗中試圖用正己烷去除脂肪步驟，發(fā)現(xiàn)對分析靈敏度有明顯影響。正已烷可能在去脂步驟導(dǎo)致部分金剛烷胺被分配除去。因此，需要用固相萃取小柱對提取液進行凈化，除去一些與金剛烷胺性質(zhì)相似的干擾物和色素等雜質(zhì)。說明金剛烷胺主要以離子的形式存在，強陽離子交換柱對其性好，背景噪音低。最終本研究采用MCX固相萃圖1不同SPE柱對回收率的影響(以外標法計，n=6)4.定容液的選擇定容液能影響目標物的峰形和響應(yīng)值，從而影響定量結(jié)果的準確性。實驗發(fā)現(xiàn)：定容液中添加甲酸可有效提高響應(yīng)值，而定容液中的有機相比例對金剛烷胺的峰形影響較大，通過對比V乙腈+V水=5+5,V乙腈+V水=3+7,V乙腈+V水=7+3,發(fā)現(xiàn)V乙腈+V水=3+7最合適，而質(zhì)譜方法一般采用0.1%甲酸提高響應(yīng)值，故采用乙腈-水(3:7,V/V)溶液(含0.1%甲酸)作為定容液。圖2未添加0.1%甲酸的定溶液譜圖(10μg/L)圖3添加0.1%甲酸的定溶液譜圖(10μg/L)5.液相色譜條件的確定金剛烷胺結(jié)構(gòu)中的氨基，易形成[M+H]+的準分子離子，適合在正離子模式下掃描，系統(tǒng)自動優(yōu)化后確定金剛烷胺的離子對、碰撞能量以及霧化氣壓力、干燥器溫度等質(zhì)譜分析參數(shù)。根據(jù)文獻，流動相中的有機相選擇甲醇和乙腈，乙腈可以明顯降低背景噪音，有效分離目標物。水相選擇了超純水和0.1%甲酸水溶液，結(jié)果如圖所示，圖2-4可見流動相為超純水時，干擾較大，響應(yīng)值差；圖2-5可見流動相為0.1%甲酸水溶液時峰形較好響應(yīng)良好。故流動相選用0.1%甲酸水溶液。在質(zhì)譜分析中，從保護質(zhì)譜配件的角度出發(fā)，甲酸一般不超過0.20%,所以本研究選擇加入0.10%甲酸。本論文采用了梯度洗脫，使金剛烷胺與雜質(zhì)可以實現(xiàn)較好的分離，提高檢測靈敏度，減少基質(zhì)影響。有機相對比了甲醇和乙腈，水相對比了超純水、0.1%甲酸溶液、5mmol/L乙酸銨和含有0.1%甲酸的5mmol/L乙酸銨溶液，發(fā)現(xiàn)流動相的酸度對金剛烷胺響應(yīng)和峰形有較大影響，本研究通過對比，最終確定采用乙腈和0.1%甲酸溶液作圖4流動相為甲醇和0.1%甲酸水的總離子流圖(10μg/L)圖5流動相為乙腈和0.1%甲酸水的譜圖(10μg/L)圖6流動相為乙腈和水的譜圖(10μg/L)圖7流動相為乙腈和含0.1%甲酸5mmol/L乙酸銨水的譜圖(10μg/L)6.基質(zhì)效應(yīng)的影響由于海洋生物基質(zhì)比較復(fù)雜，因此，在生物樣品的提取中有必要對處理后的基質(zhì)效應(yīng)進行評價。比較凈化后的空白樣品的提取凈化液與標準溶液在相同金剛烷胺濃度下的響本研究通過對比空白大黃魚、大菱鮮、刺參、海帶、南美白對蝦經(jīng)前處理后分別用1mL標準溶液溶解測定其響應(yīng)值(B,n=6)與1mL標準溶液直接上機測定(A,n=6)的比值來計算絕對基質(zhì)效應(yīng)，如圖11所示負值為離子增益，金剛烷胺在海洋生物體中存在基質(zhì)效應(yīng)。由于基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生原因復(fù)雜，因而難以根本清除基質(zhì)效應(yīng)的影響。目前用以清除或補償基質(zhì)效應(yīng)的方法有基質(zhì)凈化法、同位素內(nèi)標法、空白基質(zhì)匹配標準溶液等。為了能較好地減小基質(zhì)效應(yīng)的影7.質(zhì)譜條件的確定本研究采用直接進樣的方式進行質(zhì)譜條件的摸索和優(yōu)化。將金剛烷胺配制成1μg/mL的甲醇溶液，在ESI+模式下進行全掃描，以選擇合適的母離子和子離子。實驗結(jié)果表明：金剛烷胺在ESI+模式下能獲得較高豐度的分子母離子個信號較強的碎片離子，用信號最強的做定量離子，另一個作輔助定性離子，并對離子傳輸管溫度、鞘氣壓力、噴霧電壓等參數(shù)進行優(yōu)化，得到完整的質(zhì)譜條件，用選擇反應(yīng)模式通過對金剛烷胺標準溶液的質(zhì)譜方法優(yōu)化，確定了質(zhì)譜條件：正離子(ESI+)模式；電離電壓為2.50kV;錐孔電壓為25V;離子源溫度為140℃;錐孔反吹氣流速為50L/h;脫溶劑氣溫度為400℃;脫溶劑氣流速為700L/h;氬氣流速為0.12mL/min;其他參數(shù)見表4。采用多反應(yīng)監(jiān)測方式對樣品進行定性和定量分析。三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中，第一個四級桿(Q1)選擇母離子，經(jīng)過在第二個四級桿(Q2)中碰撞解離，到達第三個四級桿(Q3)進行選擇離子檢測，只有符合特定條件的離子才能被檢測到，該模式排除了本底干擾，具有較高的選擇性和信噪比，較低的檢測限。表4待測物監(jiān)測離子8.標準曲線的繪制50μL、100μL于樣品瓶中，分別添加100μL內(nèi)標工作液，定容至1.00mL,配制成金剛烷胺濃度為10μg/L、20μg/L、以各標準溶液峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以各標準工作液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。所得典型標準曲線方程為Y=0.06601X+0.67559,相關(guān)系數(shù)r為0.9995,大于0.99,線性關(guān)系良好，適用于海洋生物體中金剛烷胺的定量9.樣品測定樣品峰與標準物質(zhì)的保留時間之差不大于0.10min,并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的特征離子均應(yīng)出現(xiàn)，要求樣品峰的各選擇離子相對強度與標準物質(zhì)相應(yīng)選擇表5試樣相對離子豐度與標準物質(zhì)相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度/(%)允許偏差/(%)10.方法的評價于空白大黃魚、大菱鮮、刺參、海帶、南美白對蝦及四角蛤蜊樣品中加入金剛烷胺及其內(nèi)標溶液，進行回收率和精密度實驗，每個濃度樣品平行測定6次，測定3個批次，檢測結(jié)果見表6。以大菱鮮為例，金剛烷胺標準溶液、空白大菱鮮及空白大菱鮮樣品中添加金剛烷胺總離子流圖如圖9、10、和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在91.5%-96.7%之間，批內(nèi)標準偏差在1.34%-4.07%之間，批間相對標準偏差在和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在92.7%-95.7%之間，批內(nèi)標準偏差在1.77%-4.19%之間，批間相對標準偏差在和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在92.4%-96.2%之間，批內(nèi)標準偏差在1.67%-3.93%之間，批間相對標準偏差在和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在93.3%-95.4%之間，批內(nèi)標準偏差在2.23%-4.60%之間，批間相對標準偏差在和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在85.0%-92.0%之間，批內(nèi)標準偏差在3.47%-7.25%之間，批間相對標準偏差在4.25%-6.38%之間；金剛烷胺在上述海洋生物體中的回收率均在70%-120%,批內(nèi)相對標準偏差及批間相對標準偏差均小于15%。表6海洋生物體中金剛烷胺回收率及精密度試驗結(jié)果目標物基質(zhì)度回收率(%)平均回收率批內(nèi)批間金剛烷胺大黃魚1大黃魚2大黃魚3大菱鮮1大菱年2大菱鮮3刺參1海帶1蝦1蝦2蝦3四角蛤蜘四角蛤蜊2四角蛤蜊3圖9金剛烷胺標準溶液總離子流圖(10.0μg/L)圖10空白大菱鮮樣品總離子流圖圖11空白大菱鮮樣品中添加金剛烷胺總離子流圖(金剛大于3,為本方法的檢出限；金剛烷胺添加量為1.0μ噪比大于10,為本方法的定量限。11.方法驗證本方法已在煙臺海關(guān)技術(shù)中心、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)和農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(舟山)進行了方法驗證試驗，這三個單位都是通過計量認證的檢驗實驗室。驗證結(jié)論表明：該方法樣品前處理方法合理，可操作性下(見表7、表8和表9)。驗證結(jié)果表明，該方法回收率穩(wěn)定，批內(nèi)相對標準偏差及批間相對標準偏差均小于15%,重現(xiàn)性好，適用于海洋生物體中金剛烷胺的測定。煙臺海關(guān)技術(shù)中心結(jié)果分析如下：在魚類中，金剛烷胺91.5%-96.8%之間，批內(nèi)標準偏差在1.27%-4.28%之間，批間相對標準偏差在2.55%-3.52%之間；在刺參中，金剛烷胺在91.8%-96.2%之間，批內(nèi)標準偏差在0.81%-3.87%之間，批間相對標準偏差在2.49%-3.14%之間；在海帶中，金剛烷胺在10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在92.9%-96.0%之間，批內(nèi)標準偏差在1.22%-3.76%之間，批間μg/kg、50μg/kg和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在92.7%-95.5%之間，批內(nèi)標準偏差在2.60%-3.90%之間，批間相對標準偏差在2.81%-3.39%之間；在貝類中，金剛烷胺在85.2%-90.0%之間，批內(nèi)標準偏差在3.67%-7.65%之間，批間相對標準偏差在5.32%-6.41%之間；金剛烷胺在上述海洋生物體中的回收率均在70%-120%,批內(nèi)相對標準偏差及批間相對標準偏差均小于15%。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)結(jié)果分析如下：在魚類中，金剛烷胺在10μg/kg、之間，批內(nèi)標準偏差在1.74%-4.17%之間，批間相對標準偏差在2.77%-3.35%之間；在刺參中，金剛烷胺在10μg/kg、50間，批內(nèi)標準偏差在1.88%-3.59%之間，批間相對標準偏差在2.67%-3.14%之間；在海帶中，金剛烷胺在10μg/kg、50間，批內(nèi)標準偏差在1.94%-4.17%之間，批間相對標準偏差在2.99%-3.40%之間；在蝦類中，金剛烷胺在10μg/kg、50間，批內(nèi)標準偏差在1.56%-3.84%之間，批間相對標準偏差在2.56%-2.94%之間；在貝類中，金剛烷胺在10μg/kg、50間，批內(nèi)標準偏差在2.23%-7.98%之間，批間相對標準偏差均在70%-120%,批內(nèi)相對標準偏差及批間相對標準偏差均小于15%。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 (舟山)結(jié)果分析如下：在魚類中，金剛烷胺在10μg/kg、之間，批內(nèi)標準偏差在1.70%-4.67%之間，批間相對標準偏間，批內(nèi)標準偏差在1.71%-4.20%之間，批間相對標準偏差在3.10%-3.36%之間；在海帶中，金剛烷胺在10μg/kg、50間，批內(nèi)標準偏差在1.76%-4.22%之間，批間相對標準偏差在2.69%-3.22%之間；在蝦類中，金剛烷胺在10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在間，批內(nèi)標準偏差在2.07%-4.34%之間，批間相對標準偏差在2.94%-3.97%之間；在貝類中，金剛烷胺在10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg添加濃度下，平均回收率在85.7%-91.6間，批內(nèi)標準偏差在3.92%-8.29%之間，批間相對標準偏差在4.79%-6.29%之間；金剛烷胺在上述海洋生物體中的回收率均在70%-120%,批內(nèi)相對標準偏差及批間相對標準偏差均小于15%。表7煙臺海關(guān)技術(shù)中心結(jié)果統(tǒng)計目標物基質(zhì)度回收率(%平均回收率批內(nèi)批間大黃魚1大黃魚2大黃魚3大菱鮮1大菱鮮2大菱鮮3刺參1海帶1蝦1蝦2蝦3四角蛤蜊1四角蛤蜊2四角蛤蜊3表8農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(廣州)結(jié)果統(tǒng)計目標物基質(zhì)度回收率(%平均回收率批內(nèi)批間大黃魚1大黃魚2大黃魚3大菱鮮1大菱鮮2大菱鮮3刺參1海帶1蝦1蝦2蝦3四角蛤蜊四角蛤蜊2四角蛤蜊3表9農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(舟山)結(jié)果統(tǒng)計目標物基質(zhì)度回收率(%)平均回收率批內(nèi)批間大黃魚1大黃魚2大黃魚3大菱鮮1大菱鮮2大菱鮮3刺參1海帶1蝦1蝦2蝦3四角蛤蜊四角蛤蜊2四角蛤蜊3我國農(nóng)業(yè)部于2005年10月發(fā)布第560號公告，明確規(guī)定禁止金剛烷胺等抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)中的銷售和使用，同年12月，農(nóng)業(yè)部又發(fā)布了《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》,規(guī)定除經(jīng)批準生產(chǎn)和使用外，在全國范圍內(nèi)對金剛烷胺的經(jīng)營以及使用環(huán)節(jié)進行大規(guī)模清查工作。2006年，美國FDA也禁止將金剛烷胺等抗病毒藥物作為獸用藥。2016年12月國家農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第2483號公告《飼料中金剛烷胺和金剛乙胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中規(guī)定金剛烷胺的檢出限為1.0μg/kg,定量限為2.0目前涉及金剛烷胺的測定方法標準有農(nóng)業(yè)部2483號公告-6-2016《飼料中金剛烷胺和金剛乙胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,DB32/T1163-2007《雞肝中金剛烷胺殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,DB22/T2268-2015《飼料中《飼料中金剛烷胺的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,DB37/T2817-2016《清解合劑中添加金剛烷胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,DB37/T2833-2016《量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,主要是對飼料和雞肉、近年發(fā)布的食品安全國家標準GB31660.5-2019《動物性食品中金剛烷胺殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,該標準適用于豬、雞和鴨的可食性組織(肌肉、肝臟和腎臟)及禽蛋中金剛烷胺殘留量的檢測，并且前處理方法采用的是正已烷，凈化效果需要進一步提升，并且該標準不適用于?，F(xiàn)有標準關(guān)注更多的是在動物源性食品和飼料中金剛烷胺殘留量的檢測，前處理方法多采用正已烷，凈化方法欠完善。鑒于目前對于海洋生物體中的金剛烷胺的檢測沒有方法標準，因此制定適用于海洋生物體中金剛烷胺殘留檢測的五、重大分歧意見的處理過程、處理意見及其依據(jù)六、對地方標準自發(fā)布日期至實施日期之間的過渡期的建議建議該標準自發(fā)布日期至實施日期之間的過渡期為一個月。建議政府有關(guān)部門及時進行標準宣貫和標準培訓(xùn)，并開展我省海洋生物體中金剛烷胺的檢測與調(diào)查，促進我省海七、其他需要說明的內(nèi)容ofamantadineresistantinfluenzaAvirusesindomesticanimalsinChina.[J].InfectionGenetics&Evolution,2013,20(12):298-303.Parkinson'sdisease.[J].Jama,1969,208(7):1168-1170.[4]PahwaR,FactorParkinsondiseasewithmotorfluctuationsanddyskine[RETIRED]:ReportoftheQualityStandardsSubcommitteeoAcademyofNeurology[J].Neurology,2006,66(7):983-995.[5]WolfE,SeppiK,KatzenschlagerR,etal.Long-termantiamantadineinParkinson'sdisease.[J].MovementDisorders,2010,25(10):1357-1formsanionchannelthatisblockedbytheantiviralaViroporinInvolvedinVirulencein[8]孫海新.雞肉中金剛烷胺殘留的生物識別材料研究與親和檢測方法建立[D].[9]Instantchicken'[2012-12-20]./chin[10]日本在進口食品監(jiān)控計劃中加入對中國產(chǎn)雞肉中金剛烷胺的檢查[EB/OL].[2013-02-20]http://news.foodmate.n[11]山東榮成市出入境檢驗檢疫局從辣椒產(chǎn)品中檢出金剛烷胺[EB/OL]:[2014-02-12]http://news.foodmate.n[12]農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]33號關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知[13]農(nóng)業(yè)部2483號公告-6-2016飼料中金剛烷胺和金剛乙胺的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.Week49endingDecembe[15]ShiraishiK,MitamuraK,SakaitagawaY,etal.HighFrequencyoVirusesHarboringDifferentMutationsinAInfluenza[J].JournalofInfectiousDiseases,2003,188(1):57-61.[16]LeeJ,SongYJ,ParkJH,etal.EmeAvianInfluenzaAVirusinSouthKorea.[J].JournalofClinicalMicrobiology,2008,[17]單芬，韋良孟，韋艷梅，等.一株H5N2亞型鸚鵡源禽流感病毒分子進化分析[18]PabbarajuK,HoKC,WongS,etal.influenzaAvirusesfromAlberta,Canada(1970-2007)[J].AntiviralRese[19]AdamantaneresistanceincirculatinghumaninfluenzaAvirCanada(1970-2007)[J].AntiviralResearch,2008,79(2):81-86.[20]BelsheRB,SmithMH,Harimantadineemergingduringtreatmentofinfluenzavirusinfection.[JevolutionofinfluenzaA(H3N2)virusesi[22]CheungCL,RaynerAmantadine-ResistantH5N1AvianInfluenzaVariantsinAsia[[23]MorrisonD,RoyS,RaynerC,ethepharmacokineticsofamantadineandoseltamiviradministeredaloneandincombination.[J].PlosOne,2007,2(12):e13[24]孫海新.雞肉中金剛烷胺殘留的生物識別材料研究與親和檢測方法建立[D].[25]ZhaoS,LiD,QiuJ,etalrimantadineandchlorpheniramineinanimalchromatography-tandemmassspectrometryafterfastsAnalyticalMethods,2014,6(17):7062.[26]WuY,CanturkB,JoHThatBindinDifferentOrienS31NMutantoftheInfluenzaAVirusM2ProtonChannel[J].JournaloftheAmerican[27]StrongDK,EisenstatDD,BrysonPediatricPatientwithRenalInsufficiency[J].DicptheAnnal[28]MacchioGJ,ItoV,SahgalV.Amantadine-induMedicine&Rehabilitation,1993,74(10):1119.[29]Hughes,B.,Flynn,S.B.,andBrodsky,M.C.Reversibleamantadine-inducedcornealedemainanadolescent.Cornea,2004,23:8[30]JengBH,Galopotentiallyirreversibleevenaftercessationofthemedication[J].Ophthalmology,Casereport*[J].AnaisBrasileirosDeDermatologia,2015[33]DB37/T2833-2016食品安全地方標準雞肉中金剛烷胺殘留量的測定液相[34]ChenY,GuoZ,WangX,etal.Samplepreparation[J]TechniquesforPharmaceuticala[36]HennionMC.Solid-PhaseExtraction:MethodCouplingwithLiquidChromatography[J].JournalofChromatographyA,1999,[38]KataokaH.Newtrendsinsamplepreparationforanalysis[J].TrendsinAnalyticalChemistry,2003,[39]張翠芬，董偉峰.氣相色譜法測定飼料中金剛烷胺藥物的含量[J].糧食與飼[40]趙盼盼，李洪波.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中的金剛烷胺[J].[41]AnastassiadesM,LehotaySJ,Stajnmethodemployingacetonitrileextraction/partitioningand"dextraction”forthedeterminationofpesticideresiduesinproduceInter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