第八章 免疫標記技術(shù)

第八章免疫標記技術(shù)中國藥科大學微生物與免疫學教研室王慧1編輯課件免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)是指用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原所進行的抗原抗體反響;三大標記技術(shù):同位素標記技術(shù)免疫熒光技術(shù)酶免疫測定2編輯課件標記免疫技術(shù)1.免疫熒光法〔immunofluorescence，IF〕2.酶免疫測定〔enzymeimmunoassay，EIA〕3.放射免疫測定法〔radioimmunoassay，RIA〕4.化學發(fā)光免疫分析〔chemiluminescenceimmunoassay，CLIA〕5免疫印跡法〔immunoblotting,Westernblot)3編輯課件第一節(jié)放射免疫測定法

〔radioimmunoassay,RIA〕4編輯課件

放射性同位素(131I,或125I)標記Ag或Ab測定Ab或Ag,通過測定放射活性判斷結(jié)果。該法常用于測定微量物質(zhì):如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及l(fā)gE等。5編輯課件VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USA

6編輯課件

與此同時，Ekins利用競爭性蛋白結(jié)合分析技術(shù)測定甲狀腺素獲得成功；開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代，是微量分析方法學上的一個突破。7編輯課件優(yōu)點：①特異性強，即抗原抗體的特異性反響；②靈敏度高，結(jié)果精確，檢測范圍10-910-12g；③操作流程簡單易行，測量和數(shù)據(jù)處理自動化；④樣品用量少、無需復(fù)雜的提純步驟；⑤應(yīng)用范圍廣泛，尤其是測量小分子半抗原。缺點：需要昂貴的檢測儀器；同位素污染。8編輯課件原理是建立在標記抗原〔或配體〕和待測抗原〔或配體〕對有限量的特異性抗體〔或受體〕的競爭性抑制反響根底上的，最終形成的放射性標記復(fù)合物與被測配體〔或抗原〕呈負相關(guān)，因而亦稱競爭性放射免疫技術(shù)。9編輯課件Ag*+ Ab?Ag*-Ab〔F〕〔B〕+Ag ?Ag-Ab10編輯課件RIA測定原理的定量示意圖

Ag*AgAbAgAb游離AgB/FB/T∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧∨‖∧6/26/83/53/82/62/84/44/811編輯課件返回12編輯課件

第二節(jié)免疫熒光法

(immuno–fluorescencetechnique

)13編輯課件原理

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體法。將抗體或抗原標記以熒光素，然后與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，借助熒光檢測儀〔熒光顯微鏡或用流式細胞儀〕測定或定位被檢抗原或抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)呈黃綠色熒光;巰基化藻紅蛋白(PE)呈橙紅色熒光。14編輯課件15編輯課件激發(fā)光和發(fā)射光16編輯課件抗原抗體反響的高度特異性熒光的敏感可測性顯微技術(shù)的高度精確性

準確、特異、靈敏、快速地檢測和定位微量物質(zhì)。17編輯課件優(yōu)點： 特異性強，速度快，敏感性高，能準確檢測少量抗原或抗體在組織細胞內(nèi)的定位分布。缺點： 非特異性染色問題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性缺乏。返回18編輯課件建立技術(shù)的必備條件1．

熒光素2．熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備3．熒光檢測儀返回19編輯課件熒光素：可以產(chǎn)生明亮熒光的染色物質(zhì)。20編輯課件

熒光的種類

自發(fā)熒光

二次熒光21編輯課件常用的熒光素返回22編輯課件熒光檢測儀

〔1〕熒光顯微鏡〔2〕熒光分光光度計〔3〕流式細胞儀〔4〕熒光偏振光分析儀23編輯課件熒光顯微鏡24編輯課件熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈25編輯課件分類：〔1〕直接熒光法:

〔2〕間接熒光法:〔3〕流式細胞術(shù)(flowcytometry):樣品(細胞)經(jīng)各種熒光素標記的不同抗體染色后可同時分析細胞表達的多種分子。26編輯課件(1)免疫熒光法：

①直接法:

簡單、快速、特異;敏感性差。

將熒光素標記在特異性抗體上，直接檢測抗原。27編輯課件返回28編輯課件②間接法:

可檢測多種不同的抗原抗體復(fù)合物，具一定通用性；敏感性高;但操作流程長、干擾因素多。將熒光素標記在第二抗體〔抗抗體〕上或標記在SPA上，檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。29編輯課件30編輯課件③補體熒光染色法：

將熒光素標記在補體的抗體上〔抗C3抗體〕，檢測抗原抗體復(fù)合物?？蓹z測所有的抗原抗體系統(tǒng)，具通用性；敏感性高；但操作流程長、干擾因素多、非特異性熒光多，補體易失活、需新鮮制備不方便。31編輯課件32編輯課件33編輯課件特殊染色法

①

雙標記免疫熒光技術(shù)②雙色免疫熒光技術(shù)③反襯染色法

返回34編輯課件①雙標記免疫熒光技術(shù) 在同一標本中，可用兩種不同顏色的熒光標記抗體進行免疫熒光染色，同時顯示兩種不同的細胞或同一細胞上不同類型的抗原。如：FITC〔黃綠色熒光〕和RB200或TRITC9〔桔紅色熒光〕。35編輯課件②雙色免疫熒光技術(shù)

如FITC標記抗體和細胞核染色劑PI〔碘化丙錠〕。36編輯課件雙重染色標本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI37編輯課件多重染色標本的多色觀察〔FITC+TexasRed+DAPI〕返回38編輯課件39編輯課件③反襯染色法

是用一種非特異染色來反襯一種免疫熒光試劑的特異性染色。如：用RB200標記牛血清白蛋白作為非特異性反襯標記，用FITC標記特異性抗體。40編輯課件41編輯課件流式細胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是七十年代開展起來的高科學技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體,同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞外表和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應(yīng)用。42編輯課件43編輯課件FACS組成示意圖44編輯課件Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)編輯課件流式細胞儀實驗原理46編輯課件47編輯課件表達量檢測

48編輯課件細胞凋亡研究

PI染色49編輯課件AV-PI雙染色50編輯課件血液學應(yīng)用：包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等51編輯課件胞內(nèi)細胞因子的檢測52編輯課件T細胞亞群分析53編輯課件第三節(jié) 免疫酶技術(shù)

〔enzymeimmunoassaytechnique〕 1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs兩組學者分別用酶代替放射性同位素制備了酶標記試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析技術(shù)〔enzymeimmunoassay，EIA〕。54編輯課件第三節(jié)酶免疫測定法

(enzymeimmunoassay，EIA)酶免疫技術(shù)是通過適當?shù)拿复倩瘜W反響和免疫反響，使抗體〔或抗原〕與酶蛋白分子結(jié)合，形成酶標抗體〔或抗原〕,該結(jié)合物保存免疫學活性的酶活性,因而既有抗原抗體反響特異性,又有酶促反響的特異性。酶分解底物后的顯色深淺可反映標本中抗原或抗體的含量。常用酶：辣根過氧物酶、堿性磷酸酶。常用方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗――ELISA55編輯課件一、原理E：酶；S:底物；P:有色產(chǎn)物；D1：供氫體；D2：D1的氧化型有色化合物

將抗原和抗體的特異性免疫反響與酶的催化反響相結(jié)合而建立的一種免疫檢測技術(shù)。56編輯課件優(yōu)點：①靈敏度高，特異性強；②可定性、定量檢測可溶性抗原和抗體；③試劑穩(wěn)定，保存時長，無同位素污染；④可肉眼半定量，也可儀器〔低廉〕定量檢測；⑤操作簡便，易于掌握和使用，且重復(fù)性好；⑥可用于定位組織細胞上的抗原或抗體成分。缺點： 標記反響較難掌握，在操作過程中容易引起酶、抗原或抗體的失活。57編輯課件

建立技術(shù)的條件

1．標記酶2．免疫酶結(jié)合物的制備3．酶標檢測儀58編輯課件常用的標記酶

①辣根過氧化物酶〔horseradishperoxidase，HRP〕②堿性磷酸酶〔alkalinephosphatase，AP〕③葡萄糖氧化酶〔glucooxidase，Glu〕④-D-半乳糖苷〔-D-galactosidase，-D-Gal〕59編輯課件60編輯課件61編輯課件二、根本類型均相酶免疫測定法酶增強免疫技術(shù)；酶減弱免疫技術(shù)；輔基標記技術(shù)2.非均相酶免疫測定法ELISA(直接法、間接法、夾心法、競爭法、抗酶抗體法〕1971年建立，稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定〔enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA〕62編輯課件直接ELISA間接ELISA〔用于檢測Ab〕63編輯課件directELISA〔forAg〕64編輯課件directELISA〔forAb〕返回65編輯課件66編輯課件67編輯課件返回68編輯課件〔3〕夾心法

〔sandwichassay〕69編輯課件夾心法70編輯課件雙夾心法返回71編輯課件72編輯課件73編輯課件ELISA雙抗體夾心法(測Ag)間接法(測Ab)加Ab,清洗加Ag形成復(fù)合物，洗滌加該Ag的另一Ab〔酶標〕，洗滌加底物，讀數(shù)加Ag，清洗加Ab形成復(fù)合物，洗滌加酶標二抗加底物，讀數(shù)聚苯乙烯微量反響板74編輯課件75編輯課件抗酶抗體法〔PAP〕76編輯課件血清IgE的檢測實驗材料酶標板〔聚苯乙烯微量板〕馬抗人抗體—〔購自北京中山公司〕辣根過氧化物酶〔〕標記的馬抗人抗體—待檢血清包被緩沖液：碳酸鈉碳酸氫鈉洗滌液封閉液：溶液反響終止液：77編輯課件實驗方法包被酶標反響板：加馬抗人抗體〔〕，孔℃孵育小時后洗滌次，分鐘次，孔，℃過夜孔

↓℃孵育后，洗滌同上酶標記抗體：參加適當稀釋度的酶標抗體，孔℃孵育后，洗滌同上底物：參加〔鄰苯二胺〕溶液，孔

↓室溫分鐘終止液：參加，孔

↓內(nèi)，用酶標儀測定各孔值，測定波長實驗結(jié)果

用待測標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均吸收值的比值〔〕

表示，當大于某一數(shù)值時〔如〕判斷為陽性，數(shù)值的大小依具體檢測要求而定。78編輯課件〔4〕競爭法 a．固相抗體競爭法

b．固相抗原競爭法 79編輯課件

a．固相抗體競爭法80編輯課件

b．固相抗原競爭法返回81編輯課件夾心ELISA競爭ELISA〔用于檢測大分子Ag〕〔用于檢測小分子Ag〕82編輯課件返回〔5〕抗體橋聯(lián)法

〔immunobridge〕83編輯課件〔6〕抗酶抗體法

〔peroxidase-antiperoxidase，PAP〕84編輯課件PO

抗

PO法返回85編輯課件酶聯(lián)免疫斑點法(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法〔ELISA〕檢測體液中游離的細胞因子〔CK〕或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的根本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和CK分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)〔ELISPOT〕。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。86編輯課件87編輯課件ELISPOT&ELISAELISA通過顯色反響，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT通過顯色反響，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率?！材承┭芯坎粌H要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率〕由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體為BD、R&D、Mabtach生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。88編輯課件原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色〞的斑點說明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。89編輯課件DirectandIndirectElISPOT

可在已包被抗體的孔中直接刺激細胞〔直接法〕，或在24孔板或燒瓶中先刺激細胞，然后放入已包被的孔中〔間接法〕。方法選擇基于：1〕檢測細胞的類型；2〕希望得到的細胞量。假設(shè)只需少量的細胞因子生成細胞，使用直接法；反之，最好使用間接法。其它步驟一致。90編輯課件ElISPOT操作過程91編輯課件92編輯課件93編輯課件94編輯課件操作過程

1.用100ul70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。2.倒去酒精，用100ulPBS洗滌3次。3.將100ul捕獲抗體參加10mlPBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋，4℃過夜。4.倒去液體，100ulPBS洗滌一次。5.每孔參加100ul2%脫脂乳PBS〔見試劑準備〕，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。7.用100ulPBS洗滌一次。8.每孔參加100ul細胞懸浮液〔含適當量的細胞和相應(yīng)濃度的刺激劑〕。細胞可預(yù)先在體外接受刺激〔間接Eli-spot〕。蓋上標準的96孔板塑料板蓋，37℃CO2孵育箱中孵育一定的時間〔15-20小時〕。這期間不要晃動或移動孔板。9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。95編輯課件11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次12.于10mlPBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時30分。13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。14.每板以10mlPBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔參加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時。15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。16.每孔參加100ulBCIP/NBT。17.室溫下反響5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜枯燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜枯燥后，讀取點數(shù)。4℃下放置一夜，點會比較明顯。96編輯課件97編輯課件98編輯課件99編輯課件返回100編輯課件101編輯課件四、通用與放大技術(shù)1．SPA通用系統(tǒng)2．ABC放大系統(tǒng)返回102編輯課件〔1〕SPA的發(fā)現(xiàn)1940年Verwey發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的某些菌株，可與人正常血清在雙相免疫擴散試驗中出現(xiàn)沉淀線。1958年Jensen用離子交換樹脂分析證明，該成分是一種細菌胞壁上不含糖的蛋白質(zhì)，命名為金黃色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA)103編輯課件Forsgren等證明SPA與IgG分子的Fc段結(jié)合，為非特異免疫反響。生產(chǎn)SPA的國際標準菌株:CowanⅠ株〔NcTc8530和ATCC12598〕不生產(chǎn)SPA的標準株:Wood46返回104編輯課件〔2〕顆粒SPA的應(yīng)用協(xié)同凝集試驗SPA吸收IgG試驗應(yīng)用IgG-SPA制備抗IgG的抗體返回105編輯課件〔3〕SPA的標記和應(yīng)用熒光素標記SPA及應(yīng)用酶標記SPA及應(yīng)用

106編輯課件酶標SPA法返回107編輯課件ABC放大系統(tǒng)

生物素-親合素系統(tǒng)〔biotin-avidinsystem〕 高度特異性高度靈敏性簡單快速平安穩(wěn)定108編輯課件〔1〕生物素、親合素、

鏈霉親合素的特性生物素〔biotin，B〕又稱維生素H、輔酶R〔羧基轉(zhuǎn)化酶的輔酶〕MW244.31，pI3.5分子式為C10H16O3N2S109編輯課件110編輯課件Biotin111編輯課件親合素〔avidin，A〕又稱卵白蛋白、抗生物素。MW68,000，pI10～10.5，為堿性蛋白，含糖量高達10%；1個親合素可與4個生物素結(jié)合；Ka=1015mol/L112編輯課件鏈霉親合素〔streptavidin，SA〕：是Streptomycesavidin菌分泌的一種蛋白質(zhì)。MW65000，pI6.0，為略偏酸性的蛋白，不含任何糖基1個鏈霉親合素可與4個生物素結(jié)合Ka=1015mol/LSA比A在實際應(yīng)用中靈敏度要高、非特異性反響要少。返回113編輯課件〔2〕生物素的標記技術(shù)生物素的活化活化生物素結(jié)合物的制備活化生物素可結(jié)合或偶聯(lián)抗體、酶、蛋白質(zhì)、多肽、激素、凝集素、糖類及DNA、RNA等

114編輯課件〔4〕生物素-親合素系統(tǒng)的應(yīng)用115編輯課件返回116編輯課件四、ELISA方法的開展1.酶聯(lián)免疫熒光測定法117編輯課件2.IgM型抗體捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗〔IgMantibodycaptureELISA,MAC-ELISA)118編輯課件3.斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗〔dot-ELISA)119編輯課件120編輯課件三、免疫金溶膠技術(shù)121編輯課件膠體金試紙條診斷是采用斑點免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是90年代初在免疫滲濾技術(shù)的根底上建立的一種簡易快速的免疫學檢測技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素〔HCG〕的測定和乙型肝炎病毒外表抗原〔HBsAg〕等檢測?！?〕斑點免疫層析試驗〔dotimmunochromatographicassay,DICA)122編輯課件膠體金〔Colloidalgold〕是氯金酸〔HAuCl4〕的水溶膠，氯金酸在復(fù)原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜