放射免疫技術(shù)

免疫學檢驗.第十九章放射免疫技術(shù).放射免疫技術(shù)的根本概念及類型放射標記物的鑒定與純化。RIA和IRMA的測定原理及關鍵技術(shù)。RIA和IRMA的臨床應用與評價本章要點.目錄放射性核素和放射性標記物的制備1放射免疫分析性2免疫放射分析3.放射免疫技術(shù)是將放射性核素高敏感的示蹤特點和抗原抗體反響的高特異性特點相結(jié)合的一種體外測定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。其根本模式是應用放射性核素標記抗原或抗體，通過免疫反響進行定量測定。具有靈敏度高、特異性強、重復性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標準化等優(yōu)點，在醫(yī)學檢驗中得到了廣泛應用。放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學原理的不同主要有兩種類型：RIA和IRMA。前言.第一節(jié)放射性核素和放射性標記物的制備放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標記物〔將放射性核素與抗原或抗體連接〕，是建立放射免疫技術(shù)的根底。.一、放射性核素的根本知識根本概念指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時釋放射線〔α、β、γ〕，又稱為放射性衰變。根本類型依據(jù)其衰變方式α衰變、β衰變、γ衰變最常用的放射性核素是125I

.125I的優(yōu)點化學性質(zhì)比較活潑，標記方法簡單，且容易獲得高比活性的標記物；在衰變過程中產(chǎn)生γ射線，便于測量且效率高；半衰期適中〔60天左右〕，且廢棄物較容易處理。125I的缺點用125I取代H，可能使原物質(zhì)免疫活性受到影響；易因發(fā)生輻射損傷而使標記抗原變性；作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。.放射性核素放射活性的檢測利用射線照射閃爍體〔NaI晶體〕，導致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍體發(fā)出一定波長的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號經(jīng)過放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標器上顯示。.二、放射性核素標記抗原抗體方法主要包括間接標記法直接標記法〔氯胺T法〕.125I-125I或125I+125I-標記物〔混合物〕Ch-T、LPO氧化取代反響〔一〕直接標記法——氯胺T法〔Ch-T〕氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標記物〔二碘酪氨酸〕，最后參加偏重亞硫酸鈉〔復原劑〕終止反響。.使用無復原劑的高比放射性碘源被標記物用量要少Ch-T用量要低控制總反響體積<200μl反響時間1分鐘~2分鐘弱堿性反響條件.〔二〕間接標記法預先將125I用Ch-T法標記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘基反響，從而使待標記物被碘化。.三、放射標記物的純化與鑒定〔一〕放射標記物的純化因游離的125I與125I標記抗原〔抗體〕分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進行別離純化聚合、損傷物標記蛋白游離125I.比放射活性高比放射性高純度完整免疫活性放射化學純度單位標記物中結(jié)合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率應大于95%免疫活性標記物與抗體結(jié)合的能力標記物與過量抗體反響百分比該值越大,標記物免疫活性好〔二〕放射標記物的鑒定.計算法自身置換法

比放射活性單位化學量標記物中所含的放射性強度單位：Ci/gmCi/mgCi/mmol比放射性過高，將影響標記物免疫活性.比放射性－計算法

結(jié)果欠準，計算簡便依據(jù)標記反響中放射性核素的利用率〔標記率〕來計算標記物的比放射性..比放射性－自身置換法比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性。作一條常規(guī)的RIA標準曲線，反響體系包括定量標記抗原、不同濃度的非標記標準品抗原、限量抗體；同時另作一條不加非標記標準品、只加抗體和不同劑量的標記抗原的自身置換曲線。.自身置換曲線

標準曲線

反響平衡后，測定B/T%。假設從兩條曲線上取一點相同的B/T%，那么〔標記物+標準品〕標準曲線=〔標記物〕自身置換曲線。由此便可直接計算標記抗原的含量，并進一步求得比放射活性。.自身置換法測定標記化合物的比放射活性，只適用于RIA的標記抗原。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體〔受體〕的親和力應相同；②非特異性結(jié)合應較小，且計算時應扣除；③制備標準曲線與自身置換曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F別離的條件要一致。.第二節(jié)放射免疫分析放射免疫分析〔RIA〕是以放射性核素標記的抗原〔Ag*〕與未標記抗原〔Ag〕競爭結(jié)合特異抗體〔Ab〕來對待檢樣品中的抗原進行定量測定的一種技術(shù)。.一、檢測原理RIA屬于競爭性分析，其根本原理是由于Ag*和Ag〔待測物Ag)對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，當三者同時存在于同一反響體系時，Ag*和Ag相互競爭結(jié)合特異性抗體。Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力.Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。.(標準Ag/樣品Ag)二、方法與類型非平衡法，即標準品抗原〔或待檢樣本〕和特異性抗體，優(yōu)先使非標記抗原與特異性抗體到達平衡，然后再參加標記抗原競爭與抗體結(jié)合。兩種類型平衡法，即標記抗原、標準品抗原〔或待檢樣本〕、特異性抗體同時參加反響體系中。.三、關鍵技術(shù)抗原抗體反響別離結(jié)合標記物〔別離技術(shù)〕放射性測定數(shù)據(jù)處理.Ag*Ag反響條件體積溫度時間pHAb(標準Ag/樣品Ag)〔一〕抗原抗體反響牢固的抗原抗體復合物.二抗體沉淀法

PEG沉淀法PR試劑法活性炭吸附法別離徹底，迅速別離試劑和過程不影響反響平衡效果不受反響介質(zhì)影響操作應簡單、重復性好經(jīng)濟〔二〕別離結(jié)合標記物.晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和〔三〕數(shù)據(jù)處理標準曲線.

RIA由于具有敏感度高、特異性強、精密度高、重復性好、用血量少、可測定小分子量和大分子量物質(zhì)等優(yōu)點，在醫(yī)學檢驗中應用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測定。

但由于放射性核素的放射性對人體會產(chǎn)生一定的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成污染，因此操作時必須加以注意。四、評價與應用.第三節(jié)免疫放射分析免疫放射分析〔IRMA〕是從放射免疫分析〔RIA〕的根底上開展起來的核素標記免疫測定，其特點為用核素標記的抗體直接與待檢抗原反響，并用固相免疫吸附劑作為B或F的別離手段。.一、檢測原理IRMA屬于非競爭性免疫結(jié)合反響，其根本檢測原理是將放射性核素〔125I〕標記在抗體上，并用過量的標記抗體與待測抗原進行非競爭性結(jié)合反響，并采用固相免疫吸附方式對B和F進行別離。檢測免疫復合物的放射性，從而得到待檢樣本的濃度。.二、方法與類型〔一〕單位點IRMA.〔二〕雙位點IRMA.三、關鍵技術(shù)抗原抗體反響別離技術(shù)放射性測定數(shù)據(jù)處理.Ab*AgAb(待檢Ag)〔一〕抗原抗體反響固相抗原抗體復合物*牢固的抗原抗體復合物.固相吸附別離技術(shù)〔二〕別離技術(shù)一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預包被抗體稀釋到3μg/ml~10μg/ml，室溫過夜，棄包被緩沖液〔含有未結(jié)合物質(zhì)和過剩標記物〕，并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而到達別離的目的；然后，再參加1%牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆谩?晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和〔三〕數(shù)據(jù)處理.

IRMA的優(yōu)點

效率高、操作簡便

靈敏度高

特異型強

穩(wěn)定性好四、評價與應用

IRMA的缺點

抗體用量較多

抗體的純化較難RMA的測定對象主要限于有兩個以上抗原決定簇的肽類或蛋白質(zhì)?？贵w適用于大分子蛋白質(zhì)和多肽類激素的檢測分析，如腫瘤標志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降鈣素、HBsAg等，某些難以標記的病毒抗原也可通過IRMA進行檢測。.小結(jié)放射免疫技術(shù)是應用放射性核