一種新型豬瘟病毒裝甲RNA質(zhì)控品有助于提高豬瘟疫病臨床檢測的準確性

摘要[目的]研制一種安全穩(wěn)定高效的豬瘟核酸檢測質(zhì)控品，為豬瘟疫病監(jiān)測提供技術支持。[方法]將豬瘟病毒核酸檢測靶基因構入至新型裝甲RNA表達載體pTMACC，轉(zhuǎn)化、表達并純化，制備豬瘟病毒裝甲RNA質(zhì)控品。借助電泳、電鏡、動態(tài)散射分析鑒定該物質(zhì)結構特性，并對其均勻性、穩(wěn)定性進行分析，評估其實用性能。[結果]該裝甲RNA顆粒含有豬瘟病毒特異性基因，序列溯源至法國Thiverval株；為RNA-蛋白復合物，顆粒呈直徑約26nm的多邊形；該質(zhì)控品均勻、穩(wěn)定，-20℃至少穩(wěn)定保存36個月；經(jīng)8家權威實驗室性能評估，該物質(zhì)可以作為豬瘟病毒核酸檢測質(zhì)控品。[結論]豬瘟病毒裝甲RNA質(zhì)控品均勻性良好，穩(wěn)定性強，無生物傳染性，核酸RNA不易降解，可穩(wěn)定保存，進一步保障豬瘟疫病的臨床檢測的準確性。1背景豬瘟(classicalswinefever，CSF)是一種由經(jīng)典的豬瘟病毒（CSFV）引起的高度接觸性、傳染性疾病，為我國二類動物傳染病，同時也是OIE必報疫病。該病的高發(fā)病率和高死亡率給全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展。目前，國內(nèi)豬瘟疫情的主要特點為溫和性、散發(fā)性、多種病原混合感染、隱性感染和亞病毒感染等，非典型豬瘟病理變化的情況時有發(fā)生，這對CSF的臨床診斷帶來了很大的困難。目前，國內(nèi)外許多研究者建立了豬瘟病毒分子生物學診斷方法。但是，由于缺乏安全穩(wěn)定的陽性質(zhì)控品，使得豬瘟核酸檢測方法很難做到全程監(jiān)控。利用AmoredRNA技術制備的裝甲RNA顆粒穩(wěn)定、易保存、安全性高，能模擬天然病毒結構特性，與臨床樣本保持一致，可作為核酸提取、擴增和擴增后分析等各個環(huán)節(jié)的質(zhì)控，確保結果的真實可靠，可有效克服傳統(tǒng)RNA物質(zhì)存在的缺陷。本研究采用一種新型裝甲RNA表達載體，將豬瘟檢測靶基因構入其載體，制備的裝甲RNA顆粒能夠代替真病毒或質(zhì)粒等物質(zhì)，用于該病核酸檢測的質(zhì)控，為豬瘟疫病監(jiān)測提供技術支持。

2結果與分析2.1CSFV靶基因PCR擴增以豬瘟活疫苗為模板提取RNA，并采用靶基因兩端特異性引物進行RT-PCR擴增。瓊脂糖電泳顯示靶基因條帶為500～750bp，與預期大?。?68bp）相符（圖1）。M：DL2000bp；1：PCR產(chǎn)物；2：空白對照。圖1靶基因PCR產(chǎn)物電泳圖2.2pTMACC-CSFV裝甲RNA結構分析借助蛋白三維模擬器（SWISS-model）對pTMACC-CSFV裝甲RNA外殼蛋白（double-CP）結構與野生型MS2噬菌體中single-CP結構分別建模（圖2）。純化的裝甲RNA顆粒進行SDS電泳分析（圖3、圖4），顯示目的蛋白位于26～42ku，約是野生型MS2噬菌體外殼蛋白分子質(zhì)量（13.7ku）的2倍，與建模預測分析一致。該物質(zhì)溶液經(jīng)過80℃熱處理后，肉眼可見溶液由透明狀變?nèi)榘咨?，瓊脂糖電泳顯示：加熱后該物質(zhì)特征性條帶呈彌散性直至消失，源自該裝甲RNA顆粒為RNA-蛋白復合物，熱處理后蛋白外殼變性，包裹RNA核酸被釋放。A:野生型噬菌體MS2中外殼蛋白三維構象模型；B:pTMACC-CSFV中外殼蛋白三維構象模型。圖2噬菌體MS2中外殼蛋白改造的蛋白三維構象模型對比M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：pTMACC-CSFV顆粒。圖3pTMACC-CSFV裝甲RNA顆粒SDS電泳分析M：1kbDNALadder；1：pTMACC-CSFV顆粒(加熱前)；2：pTMACC-CSFV顆粒(加熱后)。圖4pTMACC-CSFV裝甲RNA顆粒核酸電泳分析2.3pTMACC-CSFV裝甲RNA形態(tài)學鑒定純化的裝甲RNA顆粒，經(jīng)1%醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡觀察（圖5）：顆粒為“外亮內(nèi)暗”規(guī)則的多邊形物質(zhì)，直徑約26nm。該物質(zhì)經(jīng)動態(tài)光散射圖譜分析（圖6）：光譜單一，且顆粒粒徑主要分布于20～50nm，且均值在26nm左右，表明溶液均勻分布，沒有顆粒聚集現(xiàn)象，且粒徑大小與透射電鏡數(shù)據(jù)吻合。圖5pTMACC-CSFV裝甲RNA顆粒透射電鏡圖圖6pTMACC-CSFV裝甲RNA顆粒動態(tài)光散射圖譜2.4裝甲RNA顆粒序列溯源性分析該物質(zhì)測序后核酸序列圖譜分析表明，插入靶標序列為豬瘟病毒5’UTR特定序列，溯源至WAOH豬瘟參考實驗室法國Thiverval株（位點1～550bp），二者同源性達99%。2.5pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品均勻性分析pTMACC-CSFV裝甲RNA均勻性檢測數(shù)據(jù)分布如圖7。采用F

檢驗統(tǒng)計分析，F(xiàn)=0.513<2.94，且P=0.848，表明該質(zhì)控品批內(nèi)精密度和總精密度差異均無統(tǒng)計學意義，呈均勻分布。圖7pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品均勻性分析圖2.6pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品保存穩(wěn)定性分析pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品在不同的保存條件下，檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分布如圖8，檢測Ct值采用t

檢驗統(tǒng)計分析。結果顯示，冷藏條件下，該質(zhì)控品穩(wěn)定保存6個月，-20℃保存條件下該質(zhì)控品能夠穩(wěn)定保存36個月。圖8pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品保存穩(wěn)定性及趨勢分析圖2.7實用性能檢測pTMACC-CSFV裝甲RNA質(zhì)控品經(jīng)8家權威實驗室進行性能評估。檢測Ct

值在20.12～22.07，符合豬瘟方法核酸陽性質(zhì)控品的要求，能夠應用于豬瘟臨床檢測。

03討論豬瘟和非洲豬瘟均是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的嚴重傳染病，在臨床和病理方面難以區(qū)分。面臨非洲豬瘟疫情防控的嚴峻形勢，豬瘟疫病的監(jiān)測也刻不容緩。隨著豬瘟核酸檢測技術的普及，一種安全、穩(wěn)定、高效的陽性質(zhì)控物質(zhì)迫切急需。本研究依托改造后的ArmoredRNA技術，采用了一種新型高效的裝甲RNA表達載體。此載體不僅能表達高達2000bp的外源RNA片段，而且優(yōu)化了純化工藝，在保證簡化工藝的同時提高了裝甲RNA顆粒的產(chǎn)量。特定CSFV靶基因插入該表達載體，制備了豬瘟裝甲RNA物質(zhì)。該物質(zhì)為RNA-蛋白復合物，即豬瘟靶基因?qū)腞NA核酸被噬菌體外殼包裹，形成類似天然病毒的結構，即核酸不易降解、又無生物安全風險，是良好的核酸檢測質(zhì)控品，能夠監(jiān)測豬瘟病毒相關核酸檢測方法中核酸抽提、反轉(zhuǎn)錄、擴增全流程，同時避免了質(zhì)粒作為質(zhì)控品易污染環(huán)境、干擾檢測結果等弊端。豬瘟病毒裝甲RNA質(zhì)控品均勻性良好，且穩(wěn)定性強。在本研究中，-20℃保存環(huán)境下檢測數(shù)據(jù)經(jīng)t

檢驗，t<0.05，且0.