8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章 基因表達(dá)及功能分析基本策略課件

第二十六章

基因表達(dá)及功能分析的基本策略STRATEGIESFORANALYZINGGENEEXPRESSIONANDFUNCTION8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略第一節(jié)基因表達(dá)的分析策略StrategiesforAnalyzingGeneExpression8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略一、通過檢測mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達(dá)分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法:例如DNA微陣列、Northern印跡、實時RT-PCR等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法:

如差異顯示PCR、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。這里主要針對已知基因的常用表達(dá)分析方法做一介紹。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（一）基于雜交原理的方法可檢測mRNA表達(dá)水平1．Northern印跡（Northernblot）既可分析mRNA表達(dá)又可驗證cDNA新序列是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術(shù)8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略Northern印跡分析原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略2．核糖核酸酶保護(hù)實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）可用于mRNA定量和RNA剪接分析是一種基于雜交原理分析mRNA的方法，既可對mRNA進(jìn)行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏度和特異性都很高。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略核糖核酸酶保護(hù)實驗原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略可對mRNA進(jìn)行區(qū)域定位

是利用雜交原理建立的組織原位mRNA檢測技術(shù)，可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位。同時也可作為定量分析的補充。通過設(shè)計與目標(biāo)mRNA堿基序列互補的寡核苷酸序列，標(biāo)記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列雜交，檢測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達(dá)分析，這是因為其較高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點和組織適用性。3．原位雜交（insituhybridization，ISH）8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的mRNA檢測方法1．反轉(zhuǎn)錄PCR可用于mRNA的半定量分析

反轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）是一種簡單、快捷地對RNA進(jìn)行定性、定量分析的方法。它是以mRNA為模板，體外擴(kuò)增cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進(jìn)行半定量分析。該方法適合對待測樣品進(jìn)行初步篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略常用于mRNA的定量分析實時定量PCR(Real-timeQuantitativePolymerasechainReaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。2．實時定量PCR8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略目前有5種技術(shù)用于實時定量PCR：其中最經(jīng)濟(jì)、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如SYBRGreen

）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；其他4種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確的擴(kuò)增子雜交，包括5’核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標(biāo)、ScropionsTM和探針雜交法，它們擁有更強的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的Southern雜交或?qū)U(kuò)增子的測序鑒定，但是成本較高。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略SYBRGreen實時定量PCR分析原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因翻譯水平的表達(dá)特征

Western印跡（Westernblot）是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽分子。當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達(dá)活性時，最常用的方法就是利用Western印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接測定基因編碼多肽8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略蛋白質(zhì)樣品的制備SDS分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Westernblot基本程序8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣品包被在支持體上，以后反應(yīng)過程與Western印跡大致相同——順序結(jié)合（即“吸附”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預(yù)先包被抗體，“吸附”抗原），再進(jìn)行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過專門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與Western印跡原理相似但形式不同8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略特點：具有特異性；靈敏度很高；穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；既可以做定性試驗也可以做定量分析。被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。酶聯(lián)免疫吸附分析8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）與免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）原理相同，都是利用標(biāo)記的特異性抗體通過抗原-抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組化實驗。近年來由于熒光標(biāo)記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。（三）免疫組化實驗可對組織/細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位檢測8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（confocalmicroscopy）對靶分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達(dá)的直觀方法。其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。運用雙重著色或多重著色程序同時對多個感興趣的靶分子進(jìn)行檢測，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry）在細(xì)胞水平分析特定蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原-抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過流式細(xì)胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞（即特異基因表達(dá)的細(xì)胞）作出判斷。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析

表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略流式細(xì)胞術(shù)可以檢測活細(xì)胞，也可以檢測用甲醛固定的細(xì)胞。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式區(qū)分細(xì)胞亞群。此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多個熒光標(biāo)記的抗體同時對多個基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和監(jiān)測，是對細(xì)胞進(jìn)行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略三、高通量檢測技術(shù)成為基因表達(dá)研究的有力工具

高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是在大量核酸、多肽信息累計（即資料庫）基礎(chǔ)上，采用微板作為分子載體，制作集成“芯片”，以自動化操作系統(tǒng)進(jìn)行分子雜交的試驗過程。因為快捷、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故稱“高通量”。高通量檢測技術(shù)適合“組學(xué)”（omics）研究，更適合生命活動過程相關(guān)的基因表達(dá)譜分析。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法基因芯片（genechip）又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)、DNA芯片（DNAchip）,是將大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、microRNA等)集成在同一基片上，組成密集分子排列，通過與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，檢測、獲取細(xì)胞或組織的基因信息。其中基因表達(dá)譜（expressionprifile）分析是目前基因芯片應(yīng)用最多的一個方面，主要采用cDNA芯片，基因表達(dá)譜芯片便于對不同狀態(tài)（如生理和病理條件）下的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）差異表達(dá)的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。（一）基因芯片和高通量測序技術(shù)可在基因水平高通量地分析基因表達(dá)8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略2.高通量測序技術(shù)是新一代基因表達(dá)譜分析方法高通量測序技術(shù)可以一次對幾十萬到幾百萬個DNA分子片段進(jìn)行序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌,又被稱為深度測序(deepsequencing)。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

在DNA水平上，可以大規(guī)模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多態(tài)性；在RNA水平上，可以對RNA片段進(jìn)行掃描、定量與鑒定，對全基因組進(jìn)行廣譜表達(dá)研究。1）目前，高通量測序技術(shù)不僅僅在DNA測序中起到重要的作用，并且已經(jīng)應(yīng)用于基因組分析的各個方面：2）高通量測序另一個被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測序方法能輕易地解決芯片技術(shù)在檢測小分子時遇到的技術(shù)難題(短序列,高度同源),而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測序的長度,同時測序方法還能在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因芯片的缺點:在于它是一個“封閉系統(tǒng)”,它只能檢測人們已知序列的特征(或有限的變異)。高通量測序的優(yōu)勢:在于它是一個“開放系統(tǒng)”,它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（二）蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳可在蛋白質(zhì)水平高通量地分析基因表達(dá)

蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）是一種對蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能進(jìn)行高通量分析的技術(shù)。是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/DNA-蛋白質(zhì)/RNA-蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質(zhì)等的相互作用。1．蛋白質(zhì)芯片有多種形式和用途8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略蛋白質(zhì)檢測芯片包括:抗體芯片抗原芯片配體芯片碳水化合物芯片等根據(jù)蛋白質(zhì)芯片制作方法和用途不同，可將其分為1.蛋白質(zhì)檢測芯片2.蛋白質(zhì)功能芯片兩大類8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)譜更多采用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)又稱二維電泳（two-dimensionalelectrophoresis,簡稱2-D電泳）。原理:

根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個屬性——等電點和分子質(zhì)量——將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對不同樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質(zhì)譜（massspectrum）技術(shù)進(jìn)行定性分析，對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定?？赏瑫r分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)。2．雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析和鑒定8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略第二節(jié)生物信息學(xué)在預(yù)測基因功能中的應(yīng)用

BioinformaticsApplicationinPredictingGeneFunction8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略一、利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因功能注釋(一）通過序列比對預(yù)測基因功能序列比對是生物信息學(xué)最基本的分析技術(shù)之一，最常用的方法是將目的DNA或蛋白質(zhì)序列與已知的DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，搜索到與目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白質(zhì)，用這些基因和蛋白質(zhì)預(yù)測目的基因和蛋白質(zhì)的功能。局部比對搜索工具BLAST是進(jìn)行序列比對的基本工具，它允許用戶選擇一條查詢序列與一個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找到數(shù)據(jù)庫中與輸入的查詢序列相匹配的項。BLAST是一個序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族，其中包括許多有特定用途的程序。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略程序查詢序列類型數(shù)據(jù)庫類型注BLASTNDNADNABLASTP蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)BLASTXDNA蛋白質(zhì)將待搜索的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列比對TBLASTN蛋白質(zhì)DNA將數(shù)據(jù)庫中的核酸序列按6個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后與待搜索的蛋白質(zhì)序列比對TBLASTXDNADNA無論是待搜索的核酸序列還是數(shù)據(jù)庫中的核酸序列都按6個閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)序列，然后比對BLAST序列數(shù)據(jù)庫搜索程序家族8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（二）利用生物信息學(xué)方法分析基因芯片數(shù)據(jù)最常用的方法有：差異表達(dá)分析（又稱基因表達(dá)差異分析）聚類分析差異表達(dá)分析的目的：識別兩個條件下表達(dá)差異顯著的基因，即一個基因在兩個條件中的表達(dá)水平，在排除各種偏差后，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略倍數(shù)分析：計算每個基因在兩個條件下的表達(dá)比值；統(tǒng)計分析中的t檢驗和方差分析：通過計算表達(dá)差異的置信度來分析差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義；建模的方法：通過確定兩個條件下的模型參數(shù)是否相同來判斷表達(dá)差異的顯著性。差異表達(dá)分析常用的分析方法有3類：8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略聚類分析所依據(jù)的基本假設(shè)：若組內(nèi)基因具有相似的表達(dá)模式，則它們可能具有相似的功能，例如受共同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因，或者產(chǎn)物構(gòu)成同一個蛋白復(fù)合體的基因，或者參與相同調(diào)控路徑的基因。在具體應(yīng)用中可按照相似的表達(dá)譜對基因進(jìn)行聚類，從而預(yù)測組內(nèi)未知基因的功能。目前已經(jīng)有很多種聚類的方法應(yīng)用到基因芯片的研究當(dāng)中，如層次聚類(Hierarchicalclustering)、K均值聚類(K-meansclustering)、自組織映射(selforganizingmap)、PCA(principlecomponetanalysis)等。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質(zhì)的功能域進(jìn)行分析將對預(yù)測基因功能提供極其有價值的信息。目前已通過多序列比對將蛋白質(zhì)的同源序列收集在一起，確定了大量蘊藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的保守區(qū)域或序列，如結(jié)構(gòu)域（domain）和模體（motif），這些共享結(jié)構(gòu)域和保守模體通常與特定的生物學(xué)活性相關(guān)，反映了蛋白質(zhì)分子的一些重要功能。

（三）通過生物信息學(xué)方法分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來預(yù)測蛋白質(zhì)功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略運用蛋白質(zhì)序列模體搜索工具預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法是：首先收集現(xiàn)有的蛋白質(zhì)家族，構(gòu)造模體數(shù)據(jù)庫；而后通過搜索該數(shù)據(jù)庫確定查詢序列是否具有可能的序列模體，判斷該序列是否屬于一個已知的蛋白質(zhì)家族；然后根據(jù)該蛋白質(zhì)家族的已知功能預(yù)測未知蛋白質(zhì)的功能。常用的模體數(shù)據(jù)庫有INTERPROSCAN、PROSITE、SMART等。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因組功能注釋常用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址描述AAThttp://genome.cs.mtu.edu/aat基因組分析和注釋工具COGhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/直系同源體簇分析數(shù)據(jù)庫EcoCychttp://ecocyc.pangeasystems.com/ecocyc/ecocyc.html大腸桿菌的基因與代謝OMIMhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/在線人類孟德爾遺傳資料PEDENThttp://pedant.mips.biochem.mpg.de/frishman/pedant.html完整基因組的生物信息學(xué)分析SAShttp://www.biochem.ucl.ac.uk/cgi2bin/sas/query.cgi結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的基因組序列分析WIThttp://www.cme.msu.edu/WIT/基因組代謝途徑重構(gòu)8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

現(xiàn)在人們已經(jīng)越來越清楚地認(rèn)識到，生物功能大多不是只由一個或幾個基因控制的，而是通過生物體內(nèi)眾多的分子（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)）共同構(gòu)成的復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)的。當(dāng)前生物學(xué)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一就是，了解生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們的動態(tài)特征。要想全面系統(tǒng)地解析這些復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)需要大量相關(guān)數(shù)據(jù)的積累，現(xiàn)代基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等大規(guī)模數(shù)據(jù)采集技術(shù)大大加快了這一進(jìn)程。目前人們已經(jīng)利用生物技術(shù)和信息技術(shù)建立了各種生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站，可為研究者提供基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑、蛋白質(zhì)相互作用等方面的信息。二、利用生物網(wǎng)絡(luò)全面系統(tǒng)地了解基因的功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

生物體任何細(xì)胞的遺傳信息、基因都是相同的，但同一個基因在不同組織、不同細(xì)胞中的表達(dá)卻不相同。一個基因的表達(dá)既影響其他的基因，又受其他基因的影響，基因之間相互促進(jìn)、相互抑制，構(gòu)成一個復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究就是：利用生物芯片等高通量技術(shù)所產(chǎn)生的大量基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)-DNA間的相互作用等信息，結(jié)合實驗室研究結(jié)果，用生物信息學(xué)方法構(gòu)建基因調(diào)控模型，對某一物種或組織的基因表達(dá)關(guān)系進(jìn)行整體性研究，從而推斷基因之間的調(diào)控關(guān)系，揭示支配基因表達(dá)和功能的基本規(guī)律。

（一）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究基因調(diào)控8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略常用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址描述EPD真核生物啟動子數(shù)據(jù)庫包含已被實驗證明的轉(zhuǎn)錄起始位點和組織特異性等啟動子的一般信息TFD轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫是轉(zhuǎn)錄因子及其特性的專門數(shù)據(jù)庫，收集有關(guān)多肽相互作用信息TRANSFAC數(shù)據(jù)庫.com/pub/database.html#transcompel提供轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)、功能、序列、DNA結(jié)合譜以及分類，還包括基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的信息TRRD轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫trrd/celcyc/收集了關(guān)于真核基因整個調(diào)控區(qū)分級結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式的信息8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物系統(tǒng)的重要生命活動過程，機體通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中分子之間的相互識別、聯(lián)絡(luò)和相互作用,實現(xiàn)整體功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。由于細(xì)胞內(nèi)各種信號通路之間存在著緊密的聯(lián)系和交叉調(diào)控,形成了非常復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)研究的目的是期望通過建立細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，闡明其在基因調(diào)控、疾病發(fā)生中的作用。生物信息學(xué)方法利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進(jìn)行通路推斷,可以幫助闡釋信號分子作用機制,輔助實驗設(shè)計,節(jié)省大量的人力物力。有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源較多。

（二）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略常用信號通路數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址描述Biocarta.biocarta.com信號通路圖片及注釋數(shù)據(jù)庫Reactome.reactome.org生物核心通路及反應(yīng)的挖掘知識庫PID.nci.nih.gov從其他數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入及文獻(xiàn)挖掘的人信號通路數(shù)據(jù)庫STKE.sciencemag.org參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子及其相互作用關(guān)系的信息AfCS.signaling-gateway.org參與信號通路的蛋白質(zhì)相互作用和信號通路圖DOQCS.ncbs.res.in細(xì)胞信號通路的量化數(shù)據(jù)庫,提供反應(yīng)參數(shù)及注釋信息SigPath.org提供細(xì)胞信號通路的量化信息8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略代謝網(wǎng)絡(luò)處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結(jié)構(gòu)組成方式反映了生物體的功能構(gòu)成。代謝網(wǎng)絡(luò)把細(xì)胞內(nèi)所有生化反應(yīng)表示為網(wǎng)絡(luò)形式，反映了代謝活動中所有化合物及酶之間的相互作用。通過基因組注釋信息可以識別出編碼催化生物體內(nèi)生化反應(yīng)的酶的基因,結(jié)合相關(guān)的酶反應(yīng)數(shù)據(jù)庫就可以預(yù)測物種特異的酶基因、酶以及酶催化反應(yīng)，由此產(chǎn)生了許多優(yōu)秀的代謝數(shù)據(jù)庫,可以方便地檢索某一生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝反應(yīng)。

（三）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究代謝途徑8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略常用代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址描述KEGG包括了700個以上物種的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、細(xì)胞過程的通路BioCyc包括了260個物種的代謝通路及基因組數(shù)據(jù)PUMA2存放了預(yù)先計算的超過200個物種的代謝通路信息BioSilico整合信息的數(shù)據(jù)庫，提供對多個代謝數(shù)據(jù)庫的訪問8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（四）利用生物網(wǎng)絡(luò)研究蛋白質(zhì)相互作用從某種程度上可以說，細(xì)胞進(jìn)行的生命活動，是蛋白質(zhì)在一定條件下相互作用的結(jié)果，若蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細(xì)胞的功能性障礙。闡明蛋白質(zhì)相互作用的完整網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有助于從系統(tǒng)的角度加深對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。近年來各種預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用的計算方法被不斷提出，將這些方法與實驗方法結(jié)合，挖掘出了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中更多的相互作用節(jié)點，目前已有多個蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫應(yīng)運而生，可用來研究蛋白質(zhì)相互作用的生物學(xué)過程。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略常用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址描述BIND.bind.ca提供參與通路的分子的序列和相互作用信息DIP專門存放實驗確定的蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù),既包括經(jīng)典實驗手段也包括高通量實驗手段確定的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)STRING存儲實驗確定的和預(yù)測得到的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，并對各種預(yù)測方法得到的結(jié)果的準(zhǔn)確性給出了相應(yīng)的權(quán)重MIPS包括酵母和哺乳動物的PPI,可靠性很高,被作為準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)使用YeastInteractome綜合多種來源的由酵母雙雜交技術(shù)確定的酵母PPI數(shù)據(jù)集,利用基因表達(dá)信息、蛋白亞細(xì)胞定位信息以及已知的各種知識對其進(jìn)行驗證形成高可信度的相互作用數(shù)據(jù)8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略三、復(fù)雜疾病的生物信息學(xué)研究策略包括信息提取、分析和建模癌癥、糖尿病、高血壓等復(fù)雜疾病對人類健康影響巨大，這類疾病的發(fā)病機制一般與多種遺傳或非遺傳因素，以及它們之間的相互作用有關(guān)，不能通過單基因、單通路、單層次的變化解釋。以系統(tǒng)的觀點解釋復(fù)雜疾病中遺傳與環(huán)境的關(guān)系、描述復(fù)雜疾病中基因的特征、分析疾病基因型與表現(xiàn)型之間的關(guān)系，已成為生物信息學(xué)研究復(fù)雜疾病的基本觀點，針對復(fù)雜疾病的研究模式，也開始從傳統(tǒng)的“序列→結(jié)構(gòu)→功能”向“相互作用→網(wǎng)絡(luò)→功能”轉(zhuǎn)變。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略①疾病的基因組合及相互作用信息的提?。杭磳?fù)雜疾病相關(guān)靶基因的識別，以及利用SNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同類型的信息，構(gòu)建疾病驅(qū)使相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)。②生物信息分析及多層次信息的融合：即從不同層次對疾病的遺傳復(fù)雜性進(jìn)行分析，對不同遺傳網(wǎng)絡(luò)間的映射算法進(jìn)行研究，進(jìn)而將SNPs、基因、蛋白質(zhì)等不同水平的信息進(jìn)行融合。③分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建模：即綜合生理病理相關(guān)的基因、SNPs、基因表達(dá)狀況，蛋白質(zhì)功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系統(tǒng)的方法將不同的測量數(shù)據(jù)、各種因素的辨識、各個層次上的相互作用關(guān)系進(jìn)行整合，建立數(shù)學(xué)模型，深入了解疾病過程、揭示復(fù)雜疾病的發(fā)病機制。復(fù)雜疾病的基本研究策略——8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略第三節(jié)基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)MethodsforIdentifyingBiologicalFunctionsofGenes8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略目前在已知的2.5萬～3萬個人類基因中，大約70%的基因我們還不清楚它們的功能，有90%的基因我們不知道它們在體內(nèi)的確切生理作用，因此，利用各種技術(shù)手段研究基因組中功能未知基因的作用，將是“后基因組時代”功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容。生物信息學(xué)利用已知數(shù)據(jù)和生物學(xué)知識進(jìn)行合理推斷,可以節(jié)省大量的人力物力，但基因功能的鑒定最終仍需要通過實驗來驗證。通常采用基因功能獲得和/或基因功能缺失的策略，觀察基因在細(xì)胞或生物個體中的，細(xì)胞生物學(xué)行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。此外，基于正向遺傳學(xué)的隨機突變篩選技術(shù)也成為揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必須在完整的生物個體及其生命過程中才能得到完整的體現(xiàn)，因此從整體水平研究基因的功能是必然的選擇。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，通過細(xì)胞或個體生物性狀的變化來研究基因的功能。常用的方法有轉(zhuǎn)基因和基因敲入技術(shù)等。一、采用功能獲得策略鑒定基因的功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenictechnology）是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞中，通過隨機重組使外源基因插入細(xì)胞染色體DNA，再將受精卵或胚胎干細(xì)胞植入受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳給后代。（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物。其基本制作過程包括：轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建，外源基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定，轉(zhuǎn)基因動物品系的建立以及外源基因表達(dá)的鑒定。1.轉(zhuǎn)基因動物可在整體水平研究基因的功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略轉(zhuǎn)基因動物制作原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略優(yōu)點：利用轉(zhuǎn)基因動物模型研究外源基因，能夠接近真實地再現(xiàn)基因表達(dá)所導(dǎo)致的結(jié)果，及其在整體水平的調(diào)控規(guī)律，把復(fù)雜的系統(tǒng)簡單化，具有系統(tǒng)性和獨立性，是目前層次最高的實驗體系。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立的疾病動物模型具有遺傳背景清楚、遺傳物質(zhì)改變簡單、更自然更接近疾病的真實癥狀等優(yōu)點。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略但轉(zhuǎn)基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：外源基因插入宿主基因組是隨機的，可能產(chǎn)生插入突變，破壞宿主基因組功能；外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等；整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳等。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身仍存在一些問題，但其在醫(yī)學(xué)研究中的重要地位是毋庸置疑的，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，其在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域必將有更加廣泛的應(yīng)用。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略目前，科學(xué)家已經(jīng)采取了多種方法使轉(zhuǎn)基因技術(shù)更加完善：為了更為精確地調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，使其獲得時空特異性的調(diào)控，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體時，選擇只在特定的細(xì)胞類型或特定的生命時期才啟動基因表達(dá)的啟動子，即可使外源基因獲得時空特異性的表達(dá)?？烧{(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)也是一種常用的方法：例如四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)可使轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)外源基因的表達(dá)受誘導(dǎo)劑（四環(huán)素）的調(diào)控，通過加入或去除誘導(dǎo)劑，就可以實現(xiàn)對外源基因表達(dá)時間及水平的控制。2.轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷完善8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略當(dāng)前轉(zhuǎn)基因動物所涉及的轉(zhuǎn)基因片段長度大多在幾十個kb以下，但是，隨著科學(xué)研究需要進(jìn)行大片段DNA、多基因或基因簇的轉(zhuǎn)基因?？寺〈笃蜠NA常應(yīng)用酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)等，可獲得200kb以上的大DNA片段，能攜帶包含完整的基因或多個基因，以及基因的所有外顯子，和附近的染色體調(diào)控區(qū)，為目的基因提供與其在正常染色體上一致的環(huán)境，保證了轉(zhuǎn)基因在正常細(xì)胞中的時空表達(dá)。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略（二）基因敲入可以實現(xiàn)基因的定向插入

基因敲入(geneknock-in)是通過同源重組的方法，用某一基因替換另一基因,或?qū)⒁粋€設(shè)計好的基因片段插入到基因組的特定位點，使之表達(dá)并發(fā)揮作用。通過基因敲入，可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前基因的功能進(jìn)行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因敲入是基因打靶技術(shù)的一種，基因打靶技術(shù)是20世紀(jì)80年代后半期發(fā)展起來的，一種按預(yù)期方式準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實驗手段。該技術(shù)的巧妙之處在于把胚胎干細(xì)胞技術(shù)和DNA同源重組技術(shù)“結(jié)合”起來，實現(xiàn)對染色體上某一基因的定向修飾和改造，從而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點突變、缺失突變、染色體組大片段刪除等。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因打靶的原理和基本步驟首先,從小鼠囊胚分離出未分化的胚胎干細(xì)胞,然后利用細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA可以與導(dǎo)入細(xì)胞的外源DNA，在相同序列的區(qū)域內(nèi)發(fā)生同源重組的原理，用含有正-負(fù)篩選標(biāo)記的打靶載體，對胚胎干細(xì)胞中的特定基因?qū)嵤按虬小保恢髮ⅰ爸邪小钡呐咛ジ杉?xì)胞移植回小鼠囊胚(受精卵分裂至8個細(xì)胞左右即為囊胚,此時受精卵只分裂不分化),移植進(jìn)去的中靶胚胎干細(xì)胞鉆入囊胚胚層,與囊胚一起分化發(fā)育成相應(yīng)的組織和器官；最后誕生出具有基因功能缺陷的“嵌合鼠”。由于中靶的胚胎干細(xì)胞保持分化的全能性,因此它可以發(fā)育成為嵌合鼠的生殖細(xì)胞,使得經(jīng)過定向改造的遺傳信息可以代代相傳。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

基因打靶的原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因功能研究的功能失活策略是通過觀察，細(xì)胞或個體的某一基因功能被部分或全部失活后，細(xì)胞生物學(xué)行為或個體遺傳性狀表型的變化，來鑒定基因的功能。常用的方法主要有基因敲除基因沉默二、采用功能失活策略鑒定基因的功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

基因敲除（geneknock-out）屬于基因打靶技術(shù)的一種，其操作步驟和原理與基因打靶技術(shù)相同?；蚯贸夹g(shù)是利用細(xì)胞染色體DNA可以與導(dǎo)入的外源DNA在相同序列的區(qū)域發(fā)生同源重組的現(xiàn)象，在ES細(xì)胞中定點破壞內(nèi)源基因，然后利用ES細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有預(yù)定基因缺陷的雜合子，通過遺傳育種最終獲得目的基因缺陷的純和個體。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善，目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。（一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被敲除后會引起胚胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。近年來，條件性基因打靶（conditionalgenetargeting）系統(tǒng)的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確，效果更加精確可靠，已達(dá)到對任何基因在不同發(fā)育階段和不同器官、組織的選擇性敲除。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略Cre/loxP系統(tǒng)作用原理示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略這一技術(shù)亦存在一些缺點：費用太高周期較長許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這些基因的功能為其他基因代償所致條件性基因打靶的優(yōu)勢：克服了重要基因被敲除所導(dǎo)致的早期致死并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及疾病發(fā)生、治療過程中的作用和機制8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略

基因沉默(genesilencing)是指由外源基因?qū)胍鸬纳矬w內(nèi)的特定基因不表達(dá)或表達(dá)受抑制的現(xiàn)象。該現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物中，后來這種現(xiàn)象在線蟲、真菌、果蠅、斑馬魚、小鼠早期胚胎中也有發(fā)現(xiàn)。目前最常用的基因沉默技術(shù)包括：RNA干涉（RNAinterference，RNAi）反義寡核苷酸（antisenseoligonucleotide，ASON）（二）基因沉默可以使基因的功能部分缺失8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略RNAi是指雙鏈RNA介導(dǎo)同源序列的mRNA特異性降解，導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。RNAi是機體的一種天然防御機制，具有防御病毒感染、入侵等功能。目前利用RNAi能夠在短時間內(nèi)高效特異地抑制靶基因表達(dá)的特點研究基因的功能已成為功能基因組學(xué)的熱點之一。1.RNA干涉技術(shù)可用來研究基因的功能8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略RNAi的作用機制：外源dsRNA可直接被導(dǎo)入細(xì)胞，或者通過轉(zhuǎn)基因、病毒感染等方式進(jìn)入細(xì)胞，并整合到基因組中獲得表達(dá)；各種來源的dsRNA被核酸酶RNaseⅢ家族中，特異識別dsRNA的Dicer酶，以一種ATP依賴的方式逐步切割成長約21~23nt的雙鏈小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)；siRNA識別mRNA鏈上的同源區(qū)域之后，結(jié)合一個核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducesilencingcomplex，RISC）；RISC定位到靶mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略RNAi的作用機制示意圖8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略目前有5種方法可用于制備siRNA：化學(xué)合成法體外轉(zhuǎn)錄法長鏈dsRNA的RNaseⅢ體外消化法siRNA表達(dá)載體法siRNA表達(dá)框架法前3種方法是在體外制備然后導(dǎo)入到細(xì)胞中；后兩種則是基于具有合適啟動子的載體或轉(zhuǎn)錄元件，在哺乳動物或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄生成。目前多采用RNA聚合酶Ⅲ啟動子構(gòu)建siRNA的表達(dá)載體或表達(dá)框架，常用的RNA聚合酶Ⅲ的啟動子有人、鼠U6啟動子、人H1啟動子。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析基本策略研究者既可以將siRNA導(dǎo)入特定細(xì)胞，在細(xì)胞水平上研究基因的功能；也可以通過轉(zhuǎn)基因的方法，在動物體內(nèi)實現(xiàn)特異、穩(wěn)定、長期地抑制靶基因的表達(dá)，從而在整體水平上研究基因的功能。若將RNAi技術(shù)與Cre/loxP重組系統(tǒng)以及基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)相結(jié)合，建立轉(zhuǎn)基因動物模型，則不僅具有穩(wěn)定、可遺傳、可誘導(dǎo)等特點，而且無需使用胚胎干細(xì)胞技術(shù)和基因打靶技術(shù)，與基因敲除相比具有簡單、易操作、周期短等優(yōu)勢。已被作為一種簡便和有效的工具廣泛用于基因功能的研究。8年制生物化學(xué)與分子生物學(xué)第26章基因表達(dá)及功能分析