植物脫毒技術(shù)

病毒危害：植物的病毒迄今為止有文獻(xiàn)記錄的為300多種〔不包括不同株系〕，受病毒危害的植物很多，多數(shù)的農(nóng)作物，特別是無(wú)性繁殖作物，都受到一種或一種以上病毒的侵染。植物病毒病原體可通過維管束傳導(dǎo)。因此，對(duì)無(wú)性繁殖的植物來(lái)說，一旦感染上病毒之后，就會(huì)代代相傳越趨嚴(yán)重。受病毒侵染的植物生長(zhǎng)緩慢、畸形、產(chǎn)量大幅度下降，品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價(jià)值。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法侵入途徑：植物病毒只能通過不至于造成寄主細(xì)胞死亡的微小傷口才能完成侵入，有些病毒是通過在寄主的細(xì)胞壁上機(jī)械地造成微傷而侵入的，有些卻需要特定的昆蟲刺吸式口器，把病毒輸入寄主的薄壁組織或韌皮部中，并建立寄主關(guān)系。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法危害病癥：當(dāng)植物受到病毒侵染以后，由于寄主植株本身的正常新陳代謝等生理機(jī)能受到干擾，使葉綠體的合成、花青素生產(chǎn)和激素的合成分配等受到顯著影響，從而使寄主植株的外觀也表現(xiàn)出不正常狀態(tài)。如植株矮小、葉片失綠或變色、分蘗及枝芽增加以及果、葉畸形等。園藝植物中有相當(dāng)多的種類是采用無(wú)性繁殖法，即利用莖、根、枝、葉、芽等通過嫁接、分株、扦插、壓條等途徑進(jìn)行繁殖的，病毒通過營(yíng)養(yǎng)體傳遞給后代，使危害逐年加重，而且園藝植物通常呈規(guī)模化集約栽培，易造成連作危害，加重了土壤傳染性和線蟲傳染性病毒的危害。植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法防治：病毒病害與真菌和細(xì)菌病害不同，不能通過化學(xué)殺菌劑或抗生素予以防治?，F(xiàn)雖有人從事病毒抑制劑的研究，但由于病毒的復(fù)制增殖是在寄主體內(nèi)完成，與寄主植物正常的生理代謝過程密切相關(guān)，而且現(xiàn)有的病毒抑制劑對(duì)植物也都有害，同時(shí)抑制劑不能治愈植物全株，當(dāng)藥效消失時(shí)病毒就很快恢復(fù)到原來(lái)的濃度。用化學(xué)殺蟲劑消滅傳播媒介昆蟲〔蚜蟲、葉蟬、線蟲、螨類等〕能減輕一些病毒的蔓延，但對(duì)于機(jī)械傳播，用化學(xué)殺蟲劑那么不能控制這類病毒病。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法“脫毒苗〞是指不含該種植物的主要危害病毒，即經(jīng)檢測(cè)主要病毒在植物內(nèi)的存在表現(xiàn)陰性反響的苗木。要脫除植株體內(nèi)所有病毒包括未知病毒是不可能的。脫苗可通過群體中未受病毒侵染的植株無(wú)性繁殖獲得。由于病毒不經(jīng)種子傳播〔豆科種子除外〕，因而也可通過種子繁殖獲得無(wú)病毒植株。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法一、莖尖培養(yǎng)脫毒二、熱處理脫毒三、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

四、其他脫毒方法植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法

植物脫毒技術(shù)

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法〔一〕通過莖尖培養(yǎng)脫毒的原理1．病毒在植物體內(nèi)的分布莖尖、根尖分生組織不含病毒粒子或病毒濃度很低。是因?yàn)椴《驹诩闹髦参矬w內(nèi)隨維管系統(tǒng)〔篩管〕轉(zhuǎn)移．在根尖與莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng)，病毒運(yùn)動(dòng)困難。病毒在寄主莖尖分生組織中的轉(zhuǎn)移速度落后于莖〔根〕尖的生長(zhǎng)速度，導(dǎo)致頂端分生組織附近病毒濃度低，培養(yǎng)便可獲得無(wú)病毒再生植株。

植物脫毒技術(shù)

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法2．莖尖大小與脫毒效果用于脫毒的莖尖外植體可以是頂端分生組織即生長(zhǎng)點(diǎn)，最大直徑0.lmm；通常是帶1～3個(gè)葉原基的莖尖〔約0.3～0.5mm〕。莖尖外植體的大小與脫毒效果成反比。但不帶葉原基的過小，外植體離體培養(yǎng)存活困難，生長(zhǎng)緩慢，操作難度大。莖尖分生組織不能合成自身需要的生長(zhǎng)素，而分生組織以下的1～3個(gè)幼葉原基可合成并供給分生組織生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素。因而帶葉原基的莖尖生長(zhǎng)快，成苗率高。但莖尖外植體過大，脫毒效果差。

植物脫毒技術(shù)

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法

植物脫毒技術(shù)

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法1．取樣：用于脫毒的植株應(yīng)是患病群體中病害相對(duì)較輕的植株?？芍苯訌倪x定的植株上取梢段進(jìn)行消毒接種。也可從室內(nèi)培養(yǎng)1～2月并進(jìn)行熱處理的盆栽扦插苗上，采頂芽與側(cè)芽消毒接種。2．消毒：剪取梢段〔也可用側(cè)芽〕3～5cm，剝?nèi)ゴ笕~片，用自來(lái)水沖洗干凈，在75％酒精中浸泡30s左右，用1％～3％次氯酸鈉或5％～7％的漂白粉溶液消毒10～20min〔或用0.1％HgCl2消毒數(shù)分鐘〕，最后用無(wú)菌水沖洗材料4～5次?！捕城o尖脫毒的方法

植物脫毒技術(shù)

一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法3．剝?nèi)∏o尖與接種在超凈工作臺(tái)上，將已消毒的芽放在墊有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中〔已滅菌〕。在雙筒解剖鏡下，用解剖針或鑷子將材料固定于視野中，用解剖刀尖仔細(xì)剝?nèi)ビ兹~，至出現(xiàn)裸露的生長(zhǎng)點(diǎn)。用刀尖切下帶1～2個(gè)葉原基的生長(zhǎng)點(diǎn)〔約0.3～0.5mm)。用解剖針或解剖刀尖將切下的莖尖轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基上〔頂部向上)，每管接1～2個(gè)莖尖。為防止莖尖失水，可用無(wú)菌水潤(rùn)濕濾紙。操作中注意隨時(shí)更換濾紙和接種工具，剝?nèi)∏o尖時(shí)切勿損傷生長(zhǎng)點(diǎn)。

植物脫毒技術(shù)一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法莖尖分生組織剝離

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一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法4．培養(yǎng)接種后材料置252℃，光照度1500～5000lx，每日光照10～16h條件下培養(yǎng)。溫度對(duì)莖尖培養(yǎng)的影響不及光照。不同植物莖尖培養(yǎng)適宜的光強(qiáng)與光照時(shí)間不同，但一般光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)效果好。培養(yǎng)兩個(gè)月左右，大的莖尖再生出綠芽，小的〔0.1～0.5mm〕莖尖那么需3個(gè)月以上，有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間才發(fā)生綠芽。其間應(yīng)更換新鮮培養(yǎng)基。提高培養(yǎng)基中BA的濃度，可形成大量叢生芽。

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一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法5．生根誘導(dǎo)一些植物莖尖培養(yǎng)形成綠芽后，基部很快發(fā)生不定根。而另一些植物不產(chǎn)生不定根，必須將無(wú)根綠苗再誘導(dǎo)才能生根成為完整植株。誘導(dǎo)生根的方法是將2～3cm高的無(wú)根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2個(gè)月即可形成根。一些植物莖尖離體培養(yǎng)極難生根，即使轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)也難奏效〔如桃、蘋果〕，這類植物的無(wú)病毒綠芽可通過微體嫁接法獲得完整植株。如果取莖尖脫毒試管苗的莖尖〔可大于第一次切取的莖尖〕，再培養(yǎng)，即二次莖尖培養(yǎng)脫毒率可達(dá)100％。

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一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法

植物脫毒技術(shù)一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法〔三〕培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式1．培養(yǎng)基適宜的培養(yǎng)基對(duì)莖尖誘導(dǎo)成完整植株有重要影響。MS培養(yǎng)基適于多種植物莖尖培養(yǎng)。White、Morel等培養(yǎng)基也有廣泛的應(yīng)用。植物應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中糖的濃度。培養(yǎng)基中參加生長(zhǎng)素〔IAA、NAA〕和細(xì)胞分裂素〔KT、BA〕或椰乳，對(duì)促進(jìn)不同大小的莖尖外植體生長(zhǎng)和分化是必要的。GA3的適當(dāng)配合，促進(jìn)效果良好。2,4-D常導(dǎo)致愈傷組織發(fā)生，應(yīng)防止使用。

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一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法2．培養(yǎng)方式莖尖培養(yǎng)一般常采用半固體〔瓊脂培養(yǎng)基〕培養(yǎng)，但去掉瓊脂的液體培養(yǎng)基效果〔濾紙橋〕更好。

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一、莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法熱處理或溫?zé)岑煼?。其根本原理是一些病毒?duì)熱不穩(wěn)定，在高于常溫的溫度下〔35℃～40℃〕即鈍化失活。因而將植物置于一定高溫下處理一段時(shí)間后，病毒失活而植物根本不受傷害。由于通過組織培養(yǎng)脫毒的各種方法均有一些缺乏之處。這些病毒及一些類病毒難以通過莖尖培養(yǎng)、微尖嫁接或愈傷組織培養(yǎng)脫除，而用熱處理那么可以脫除。

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二、熱處理脫毒

第一節(jié)脫毒方法熱處理方法〔1〕溫湯處理將材料放置50℃左右熱水中浸數(shù)分鐘至幾小時(shí)，可使病毒失活。此法簡(jiǎn)便易行，適于離體材料和休眠器官的處理，缺點(diǎn)是易傷害材料。

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二、熱處理脫毒

第一節(jié)脫毒方法〔2〕熱風(fēng)處理將盆栽植物移入室內(nèi)或生長(zhǎng)箱中，以35℃～40℃溫度處理幾十分鐘至數(shù)月。按植物種類、器官類別和生理狀況及待脫除病毒的種類等，確定處理溫度與處理時(shí)間。如草莓以36℃處理6周可脫除輕型黃邊病毒〔SMYES〕，馬鈴薯以37℃處理20d就可脫除卷葉病毒〔PLR〕。此外，每種植物都有熱處理臨界溫度，過高溫處理會(huì)造成對(duì)植物的傷害。采用變溫處理那么可消除病毒不傷及植物，如以每天40℃4h與16℃～20℃20h交替變溫處理馬鈴薯塊莖，既去除了芽眼中的病毒，又保持了芽的活力。

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二、熱處理脫毒

第一節(jié)脫毒方法

植物脫毒技術(shù)

二、熱處理脫毒

第一節(jié)脫毒方法盡管分生組織常常不帶病毒，但也有一些植物莖尖帶有病毒。在麝香石竹0.1mm的莖尖培養(yǎng)中，33%的材料帶有麝香石竹斑駁病毒。在菊花莖尖培養(yǎng)中，由0.3～0.6mm長(zhǎng)的莖尖愈傷組織形成的植株全部帶有病毒。能侵染莖尖分生組織區(qū)域的其他病毒還有馬鈴薯花葉病毒〔TMV〕、馬鈴薯X病毒〔PVX〕以及黃瓜花葉病毒〔CMV〕。在這種情況下，把莖尖培養(yǎng)和熱處理結(jié)合起來(lái)，能明顯提高脫毒率。

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三、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法是在單獨(dú)使用熱處理或單獨(dú)使用莖尖培養(yǎng)都不奏效時(shí)使用。如侵染菊花的病毒有10余種，象菊花矮縮病毒〔CSV〕和菊花番茄不孕病毒〔TAV〕，就可以通過使植物在35℃～38℃條件下，處理2個(gè)月，來(lái)到達(dá)經(jīng)熱處理使病毒失活的去病毒效果〔不經(jīng)組織培養(yǎng)〕。如果要去除或盡量削弱退綠斑駁病毒、輕斑駁病毒、B病毒等，那么單用熱處理難以奏效，必需通過莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理來(lái)實(shí)驗(yàn)脫毒效果。如，在38℃下處理140d，未能去除康乃馨蝕環(huán)病毒，結(jié)合莖尖培養(yǎng)那么可以除去。植物脫毒技術(shù)

三、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法

熱處理可以在莖尖離體之前的母株上進(jìn)行，也可以在莖尖培養(yǎng)期間進(jìn)行。前一種方法可以使母枝快速生長(zhǎng)，莖尖生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于病毒復(fù)制和傳播的速度，離體莖尖外植體可以比不經(jīng)熱處理的大一點(diǎn)，這樣既可以保證高的脫毒率，又可以提高離體莖尖的存活率和再生植株百分?jǐn)?shù)。熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒方法已成功地用來(lái)對(duì)馬鈴薯、菊花、石竹、草莓進(jìn)行脫毒。植物脫毒技術(shù)

三、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法

植物脫毒技術(shù)三、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

第一節(jié)脫毒方法〔一〕愈傷組織培養(yǎng)脫毒〔二〕珠心胚培養(yǎng)脫毒〔三〕微尖嫁接脫毒〔四〕花藥培養(yǎng)脫毒〔五〕蒜薹圓盤培養(yǎng)脫毒〔六〕化學(xué)處理

植物脫毒技術(shù)四、其它脫毒方法

第一節(jié)脫毒方法將感染病毒的組織離體培養(yǎng)獲得愈傷組織，再誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗，從而獲得無(wú)病毒植株的方法，即愈傷組織培養(yǎng)脫毒法。依據(jù)是愈傷組織細(xì)胞帶病毒不均一，局部細(xì)胞不帶病毒，由這些細(xì)胞再生出的植株是無(wú)病毒的。屢次繼代的愈傷組織中病毒濃度下降。甚至檢測(cè)不出病毒?！惨弧秤鷤M織培養(yǎng)脫毒

植物脫毒技術(shù)四、其它脫毒方法

第一節(jié)脫毒方法一是愈傷組織細(xì)胞分裂增殖速度快，而病毒復(fù)制速度較慢，趕不上細(xì)胞的繁殖；二是愈傷組織細(xì)胞發(fā)生了抗病毒突變。此外，在母株上也存在抗病毒的細(xì)胞，它們與感病毒的細(xì)胞并存，采用它們存在部位的組織離體培養(yǎng)，所獲再生植株中有較高比例的無(wú)毒株。馬鈴薯莖尖愈傷組織再生植株中，不含馬鈴薯X病毒〔PVX〕植株的頻率高達(dá)46％，遠(yuǎn)高于莖尖直接成苗植株的頻率。愈傷組織細(xì)胞不帶病毒可能有以下兩方面的原因

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四、其它脫毒方法

第一節(jié)脫毒方法〔二〕珠心胚培養(yǎng)脫毒柑橘類種子為多胚種子，除具有合子胚外，還有多個(gè)珠心胚。珠心胚由珠心組織細(xì)胞即體細(xì)胞分化形成，具有和母體相同的遺傳特性。病毒一般不通過種子傳播，因而通過珠心胚培養(yǎng)獲得的再生植株是無(wú)毒的，同時(shí)又保存了母株的遺傳特性。

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四、其它脫毒方法

第一節(jié)脫毒方法柑橘珠心胚培養(yǎng)直接取花后約7周的幼果胚囊，接種后，先在25±2℃黑暗條件下培養(yǎng)一個(gè)月，再轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)〔1000lx，12h〕。3～4周即發(fā)生球形胚和愈傷組織，9～10周分化子葉，苗高3cm左右移植到營(yíng)養(yǎng)缽蛭石基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，7周左右可移栽到土中。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法珠心胚大多不育，必須經(jīng)別離培養(yǎng)才能長(zhǎng)成正常植株。此外，珠心胚苗處于童期，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)旺，還帶有局部野生性狀〔多刺〕，結(jié)果遲，柑橘珠心胚苗需栽培7～8年才能結(jié)果，占地費(fèi)時(shí)。使這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用受到很大制約。為了縮短珠心胚苗的童期，可將珠心胚芽嫁接到栽培3年的實(shí)生砧木上，以促其早結(jié)果。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法〔三〕微尖嫁接脫毒微尖嫁接技術(shù)，指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)實(shí)生砧木，嫁接無(wú)病毒莖尖〔0.14～1.0mm，帶3～4個(gè)葉原基〕以培養(yǎng)脫毒苗的技術(shù)。這一方法適用于莖尖培養(yǎng)脫毒生根困難，不能形成完整植株的植物，如柑橘、桃、蘋果等。莖尖來(lái)源包括成年無(wú)病毒植株的莖尖、熱處理或溫室培養(yǎng)植株的莖尖以及脫毒試管苗莖尖等，以熱處理植株莖尖嫁接應(yīng)用最廣泛。

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法試管嫁接

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法無(wú)菌砧木培養(yǎng)→莖尖準(zhǔn)備→嫁接→嫁接苗培養(yǎng)→移植。1．砧木培養(yǎng)用新鮮果實(shí)種子去種皮后接種子含MS無(wú)機(jī)鹽的無(wú)激素瓊脂培養(yǎng)基上，在25±2℃下暗培養(yǎng)2周，再轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)。2．莖尖準(zhǔn)備供體株多用熱處理或溫室培養(yǎng)植株，對(duì)采集的嫩稍消毒和剝?nèi)∏o尖。

微尖嫁接脫毒主要程序

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法3．嫁接從試管中取出砧木，切去過長(zhǎng)的根，保存4～6cm根長(zhǎng)，切頂留1.5cm左右莖。在砧木近頂處一側(cè)切一個(gè)“U〞形切口，深達(dá)形成層，用刀尖挑去切口部皮層。將莖尖移置砧木切口部，莖尖切面緊貼切口橫切面。

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法4．嫁接苗培養(yǎng)微尖嫁接苗一般采用液體濾紙橋方式培養(yǎng)。事先在紙橋中開一小孔，將砧木的根通過小孔植入液體培養(yǎng)基，按常規(guī)光照培養(yǎng)管理。開始可用較低光強(qiáng)800～1000lx。長(zhǎng)出新葉后可提高光強(qiáng)。5.移栽嫁接苗培養(yǎng)3～6周，具2～3片葉時(shí)按一般試管苗移植方式移入蛭石、河沙、椰殼等基質(zhì)中培養(yǎng)。

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法即將嫁接苗去根并削去砧木局部的皮層作為“接穗〞，嫁接到盆栽粗壯砧木上，扎緊切口井罩以塑料袋保濕，20d左右成活，即可摘去塑料袋。用再嫁接式移栽的柑橘微尖嫁接脫毒苗成活率高?！霸偌藿邮揭圃渊?/p>

植物脫毒技術(shù)

第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法〔四〕花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本大澤勝次首先發(fā)現(xiàn)，草莓花藥培養(yǎng)可產(chǎn)生無(wú)病毒植株。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，草莓花藥培養(yǎng)脫毒率高于莖尖脫毒率，一般可達(dá)80％以上；有些報(bào)道指出可達(dá)100％。因此，大澤勝次認(rèn)為草莓花藥培養(yǎng)脫毒，可以免去脫毒檢測(cè)程序。草莓花藥培養(yǎng)產(chǎn)生二倍體植株頻率很高，且操作較莖尖培養(yǎng)脫毒簡(jiǎn)便。這些特點(diǎn)使草莓花藥培養(yǎng)脫毒成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外草莓無(wú)病毒苗培育主要方法之一。

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法〔五〕蒜薹圓盤培養(yǎng)脫毒

將外表消毒的感病大蒜的鱗片〔蒜瓣〕切成薄片，接種在含激素的培養(yǎng)基上，5d后從圓盤外表長(zhǎng)出半球體，看起來(lái)很像是生長(zhǎng)點(diǎn)，在培養(yǎng)10d之前半球體是無(wú)毒苗的。在培養(yǎng)的5～7d后，將半球體從外植體上剝離，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的LS培養(yǎng)基上，經(jīng)過2周長(zhǎng)成高約1cm的苗，8周后形成帶根的高約8cm的試管苗。移栽到土壤中后，它們生長(zhǎng)健康，不呈現(xiàn)帶病毒病癥。〔六〕化學(xué)處理1.病毒抗血清預(yù)處理用齒舌蘭環(huán)斑病毒〔ORV〕的血清處理蘭屬離體分生組織，提高了再生株中無(wú)ORV的植株頻率。2.RNA抑制劑處理煙草愈傷組織培養(yǎng)基中參加2-硫脲嘧啶，可除去組織中馬鈴薯Y病毒〔PVY〕。放線菌D和放線菌酮能抑制原生質(zhì)體中病毒的復(fù)制。3.三氯唑核苷：病毒唑，化學(xué)名稱1,2,4-3唑-3-酰胺-1-β-D-呋喃核苷，防治動(dòng)物RNA病毒和DNA病毒病的廣譜性抗病毒制劑。

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第一節(jié)脫毒方法四、其它脫毒方法一、直接檢測(cè)法二、指示植物法三、抗血清鑒定法四、分子生物學(xué)鑒定法五、電鏡檢測(cè)法

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第二節(jié)脫毒苗鑒定

直接觀察植株生長(zhǎng)狀態(tài)是否異常，莖葉上有無(wú)特定病毒可見病癥，從而可判斷病毒是否存在。如矮縮病毒引起寄主植物葉片腿綠、壞死、扭曲、植株矮縮，花葉病毒引起寄主植物葉片脈間失綠等。簡(jiǎn)便、直觀、準(zhǔn)確。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定一、直接檢測(cè)法植物脫毒技術(shù)對(duì)某種或某幾種病毒及類似病原物或株系具敏感反響并表現(xiàn)明顯病癥的植物稱為指示植物?！惨弧巢荼局甘局参镨b定1．汁液涂抹法：取待測(cè)植物幼葉1～3g，加少量水及等量0.1mol/l磷酸緩沖液磨成勻漿。在指示植物葉上涂上一薄層500～600目的金剛砂，用脫脂棉球蘸勻漿在葉片上輕輕摩擦，以汁液進(jìn)入細(xì)胞又不損傷葉片為度。5min后，以清水沖洗葉面多余的勻漿及金剛砂。置放蟲網(wǎng)內(nèi)數(shù)天至數(shù)周。觀察是否有病癥。

第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法汁液涂抹法的操作步驟

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第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法蘋果莖溝病毒昆諾藜鑒定蘋果莖溝病毒莧色藜鑒定

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第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法2．小葉嫁接法取待測(cè)植物小葉嫁接到指示植物葉上，根據(jù)被嫁接指示植物葉上有無(wú)病毒病癥，鑒定待測(cè)植物病毒。每株指示植物至少嫁接2片小葉，假設(shè)待測(cè)植物有病毒，嫁接后15～25d，即會(huì)產(chǎn)生病癥。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法〔二〕木本指示植物鑒定1．直接在指示植物上嫁接待檢植株的芽片。２．雙重芽嫁接先將指示植物的芽嫁接到實(shí)生砧木基部距地面10～12cm處，再在接芽下方嫁接待檢植物芽，兩芽相距2～3cm。成活后剪去指示植物芽上部砧干。夏秋季芽接，次年可觀察。

植物脫毒技術(shù)

第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法〔3〕雙芽嫁接法在休眠期剪取指示植物和待檢植物的接穗，萌芽前分別把帶有兩芽的指示植物接穗與待檢植物接穗同時(shí)切接在實(shí)生砧木上，指示植物接穗接在待檢接穗上方。

植物脫毒技術(shù)

第二節(jié)脫毒苗鑒定二、指示植物法〔一〕原理人和動(dòng)物感病后，血清中會(huì)產(chǎn)生抗體。刺激抗體產(chǎn)生的物質(zhì)多為蛋白質(zhì)，稱為抗原。抗原與抗體間能發(fā)生高度專一性的反響，稱為血清學(xué)反響〔免疫反響〕。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定三、抗血清鑒定法抗體存在于血清中，故叫抗血清。植物病毒是核酸和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，因此，也是一種抗原，注射到動(dòng)物體內(nèi)，會(huì)引起相應(yīng)特異抗體的產(chǎn)生。因此，利用特定病毒的抗血清．通討血清學(xué)反響即可檢測(cè)該種病毒?？寡彖b定方法專一性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便。別離純化病毒〔抗原〕，制備純潔的抗血清是抗血清鑒定中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。植物病毒抗血清的制備方法是：先提取、純化植物病毒，將高純度病毒注射到動(dòng)物〔如家兔、山羊、老鼠〕體內(nèi)，再?gòu)膭?dòng)物血液中提取和純化抗血清。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定三、抗血清鑒定法〔二〕方法1．葉綠體凝集法采用待檢植物葉片提取液與專一抗血清發(fā)生凝結(jié)反響檢測(cè)植物病毒，如煙草花葉病毒，馬鈴薯Y病毒等長(zhǎng)形病毒2．試管沉淀法即各種稀釋的抗血清與病毒抗原在小試管中混合反響而產(chǎn)生沉淀，是常用的病毒檢測(cè)方法之一。長(zhǎng)形病毒形成絮狀沉淀，球形病毒形成濃密粒狀沉淀。

植物脫毒技術(shù)

第二節(jié)脫毒苗鑒定三、抗血清鑒定法3．環(huán)形接口法在毛細(xì)管或細(xì)長(zhǎng)玻管中，抗原抗體通過擴(kuò)散結(jié)合。病毒抗原位于上部呈層狀，少量抗血清向毛細(xì)管滲入，至到達(dá)足夠的抗原/抗體比率時(shí)，在該區(qū)域產(chǎn)生可見沉淀物。此法簡(jiǎn)單快速。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定三、抗血清鑒定法根本原理是用化學(xué)處理方法將酶與抗體〔或抗原〕結(jié)合，制成酶標(biāo)抗體〔原〕，這些酶標(biāo)記物仍保持其免疫活性，能與相應(yīng)抗體或抗原特異結(jié)合形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物，遇相應(yīng)底物時(shí)，免疫復(fù)合物上的酶催化無(wú)色的底物，降解生成有色產(chǎn)物或沉淀物，前者可用比色法定量測(cè)定，后者可肉眼觀察或通過光學(xué)顯微鏡識(shí)別。4．酶聯(lián)免疫吸附分析法〔ELISA〕

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第二節(jié)脫毒苗鑒定三、抗血清鑒定法1．雙鏈RNA法〔dsRNA〕在受RNA病毒侵染的植物體內(nèi)，有相應(yīng)復(fù)制形式的雙鏈RNA〔dsRNA〕存在，而在健康植株中未發(fā)現(xiàn)病毒的dsRNA。通過提取純化待測(cè)植物RNA，并對(duì)其進(jìn)行電泳分析，可確定有無(wú)dsRNA存在，從而判斷待檢植物是否帶病毒。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定四、分子生物學(xué)鑒定法

2．互補(bǔ)DNA〔cDNA檢測(cè)法〕用互補(bǔ)DNA〔cDNA〕檢測(cè)病毒的方法又稱DNA分子雜交法。根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，人工合成能與病毒堿基互補(bǔ)的DNA〔cDNA〕即cDNA探針，用cDNA探針與從待檢植物中提取的RNA進(jìn)行DNA－RNA分子雜交，檢測(cè)有無(wú)病毒RNA存在，從而確定植物體內(nèi)有無(wú)該病毒。合成cDNA時(shí)，采用同位素標(biāo)記。因而檢測(cè)結(jié)果可通過放射自顯影顯示在圖像上，直觀、準(zhǔn)確。

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第二節(jié)脫毒苗鑒定四、分子生物學(xué)鑒定法

3．聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CRreversetranscriptionPCR,RT-PCR

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第二節(jié)脫毒苗鑒定四、分子生物學(xué)鑒定法

五、電鏡檢測(cè)法運(yùn)用電子顯微鏡可直接檢測(cè)待檢植物體內(nèi)有無(wú)病毒粒體存在，并根據(jù)所觀察病毒的形態(tài)、大小對(duì)病毒種類進(jìn)行鑒定。完整成熟的病毒稱為病毒粒體，有固定形態(tài)和大小。病毒粒體的形態(tài)有桿狀、線狀、球狀3種。ISEM：把電鏡檢測(cè)與血清學(xué)方法結(jié)合建立了免疫吸附電鏡檢測(cè)法〔ISEM〕。ISEM具有更高靈敏度并能測(cè)定植物粗提取液中的病毒。

植物脫毒技術(shù)

第二節(jié)脫毒苗鑒定

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第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存一、脫毒苗的繁殖脫毒苗的培育是很不容易的，因此一旦培育獲得脫毒苗植株，就應(yīng)盡快繁殖擴(kuò)大以應(yīng)用于生產(chǎn)。通常的繁殖方法是將得到的脫毒植株在無(wú)菌條件下切段繁殖，利用腋芽在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)形成大量脫毒小苗。離體條件下采用切段繁育獲得的大量脫毒苗，應(yīng)種植在防蟲網(wǎng)室內(nèi)，一般以使用300目的網(wǎng)紗為好，網(wǎng)眼為0.4～0.5mm大小的規(guī)格，可以防止昆蟲類介體進(jìn)入。栽培苗床的土壤應(yīng)進(jìn)行消毒，周圍環(huán)境也要整潔，及時(shí)打藥滅菌，保證種植的脫毒苗在遠(yuǎn)隔病毒傳染源的條件下生長(zhǎng)發(fā)育。有條件的地方可以找適宜的海島或高冷山地，氣候涼爽，蟲害少，有利于脫毒植株的生長(zhǎng)、繁殖。

植物脫毒技術(shù)

馬鈴薯良種生產(chǎn)體系〔一〕生產(chǎn)原原種利用脫毒苗生產(chǎn)無(wú)任何病害的原原種，是良種生產(chǎn)體系的核心。生產(chǎn)原原種可利用脫毒苗移栽法，但目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法是用脫毒苗在溫室〔網(wǎng)室〕中切段扦插。其優(yōu)點(diǎn)有三：①節(jié)省投資。②繁殖速度快。③方法簡(jiǎn)單。一、脫毒苗的繁殖

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存〔二〕生產(chǎn)原種原原種生產(chǎn)本錢高，生產(chǎn)的種薯數(shù)量有限，遠(yuǎn)不能用于生產(chǎn)，所以需要把原原種擴(kuò)大繁殖，生產(chǎn)一級(jí)和二級(jí)原種。原種的生產(chǎn)規(guī)模比原原種大得多，不可能全用溫室或網(wǎng)室。雖然如此，但仍需要生產(chǎn)高質(zhì)量的種薯，特別是一級(jí)原種應(yīng)接近完全健康。因而生產(chǎn)原種需要選擇適當(dāng)?shù)牡攸c(diǎn)。原種生產(chǎn)田應(yīng)具備的條件：①地勢(shì)高寒，蚜蟲少。②霧大、風(fēng)大，有翅蚜蟲不易飛遷、降落的地方。③天然隔離條件好，如森林中間的空地，四周環(huán)山的高地，海邊土質(zhì)好的島嶼等。④無(wú)傳播病毒和細(xì)菌性病害的土地。

一、脫毒苗的繁殖

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存植物脫毒技術(shù)

〔三〕生產(chǎn)良種良種來(lái)自一級(jí)原種或二級(jí)原種。第一次用原種生產(chǎn)的種薯為一級(jí)良種，一級(jí)良種再種一次即為二級(jí)良種。一級(jí)原種的種薯量大時(shí)可直接用來(lái)生產(chǎn)一級(jí)良種，一級(jí)良種的種薯量大時(shí)可直接向種植戶提供種薯。種植戶生產(chǎn)的馬鈴薯只能供市場(chǎng)銷售食用，不作種薯。但如果一級(jí)原種或一級(jí)良種的種薯量少，均可再繁殖一次到二級(jí)原種時(shí)才生產(chǎn)一級(jí)良種，把一級(jí)良種再繁殖一次的種薯供給種植戶生產(chǎn)上用。

一、脫毒苗的繁殖

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存植物脫毒技術(shù)

二、脫毒苗的保存

植物脫毒技術(shù)

〔一〕隔離保存應(yīng)將脫毒原原種苗種植于防蟲網(wǎng)室、栽在盆缽中保存。栽培基質(zhì)應(yīng)事先消毒處理。除去網(wǎng)室周圍的雜草和易滋生蚜蟲等傳播媒介的植物，保證環(huán)境清潔，并定期噴藥劑防蟲殺菌。凡接觸脫毒苗的工具應(yīng)消毒并單獨(dú)保管專用，操作人員也應(yīng)穿消毒的工作服。假設(shè)有條件，最好將脫毒苗母本園建在相對(duì)隔離的山上。對(duì)隔離保存的脫毒種苗要定期檢測(cè)有病毒感染，及時(shí)將再感染的植株淘汰或重新脫毒。假設(shè)管理得當(dāng)，材料可保存5~10年。

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存〔二〕離體保存將無(wú)病毒苗原種的器官或幼小植株接種到培養(yǎng)基上，在低溫下離體保存，是長(zhǎng)期保存植物無(wú)病毒原種及其他優(yōu)良種質(zhì)的方法。1．低溫保存2．超低溫保存

植物脫毒技術(shù)

二、脫毒苗的保存

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存1．低溫保存莖尖或小植株接種到培養(yǎng)基上，置低溫〔1～9℃〕、低光照下保存。低溫下材料生長(zhǎng)極緩慢，只需半年或一年更換培養(yǎng)基一次，此法又叫最小生長(zhǎng)法。

植物脫毒技術(shù)

二、脫毒苗的保存

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存2．超低溫保存超低溫主要指液氮〔－196℃〕及液氮蒸汽相條件。冷凍和化凍過程最易引起材料的傷害。原因主要有兩個(gè)方面：一是細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞死亡。二是細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃縮。細(xì)胞質(zhì)最初是高滲透壓的，故一般先致細(xì)胞外結(jié)冰，增加了細(xì)胞外溶液的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓梯度發(fā)生反轉(zhuǎn)，即細(xì)胞失水，并逐漸變?yōu)槊撍疇顟B(tài)。植物材料在超低溫下長(zhǎng)期保存，并在解凍后正常地進(jìn)行細(xì)胞分裂和分化，在冰凍過程中要防止細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，在解凍過程中防止細(xì)胞內(nèi)水分的次生結(jié)冰。冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜、聚乙二醇〔PEG〕、甘油及多種糖類等。

二、脫毒苗的保存

第三節(jié)脫毒苗的繁殖和保存植物脫毒技術(shù)

〔三〕生長(zhǎng)抑制保存通過高滲、生長(zhǎng)抑制劑以及其他一些措施到達(dá)延緩離體培養(yǎng)材料生長(zhǎng)發(fā)育，延長(zhǎng)繼代轉(zhuǎn)接時(shí)間，從而到達(dá)保存離體培養(yǎng)材料的目的。1．生長(zhǎng)抑制劑保存法是在培養(yǎng)基中參加生長(zhǎng)抑制劑以減緩培養(yǎng)材料生長(zhǎng)，到達(dá)長(zhǎng)期保存種質(zhì)材料的保