PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置課件

PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置山東省疾控細(xì)菌所

2013-11-19

PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置目錄PFGE基本原理參數(shù)設(shè)置實(shí)驗(yàn)流程細(xì)菌分型原理PFGE需配備的相關(guān)儀器PFGE所需耗材清單PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置基本原理通常的瓊脂糖凝膠電泳利用雙鏈DNA分子在電場作用下，在凝膠中的遷移率不同而達(dá)到分離的目的。當(dāng)雙鏈DNA分子超過一定的大小以后，DNA雙螺旋的半徑超過了凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會(huì)達(dá)到極限，我們稱之為“極限遷移率”，此時(shí)凝膠不能按照分子大小來篩分DNA。有實(shí)驗(yàn)證明，長度超過40KB的DNA分子不能在恒強(qiáng)水平瓊脂糖凝膠電泳中分離PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置基本原理PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置基本原理PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置與常規(guī)的直流單向電場凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場方向的交變電源，每次電流方向改變后可持續(xù)1s到5min左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以將其稱之為脈沖式交變電場。目前PFGE裝置有垂直脈沖場、電場翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)、鉗位勻強(qiáng)電場（CHEF)等電泳系統(tǒng)。基本原理PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置

PFGE方法用來研究細(xì)菌的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，能夠?qū)θ蚪M進(jìn)行分析，最終分析的DNA超過90%，可以從整個(gè)基因組的角度考慮菌株

間的關(guān)系。用稀有位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切可以獲得菌種某亞種特有的電泳圖譜，是PFGE技術(shù)的顯著優(yōu)勢。靈敏、分型能力強(qiáng)：電場是不斷改變的，有利于DNA的遷移重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化。“金標(biāo)準(zhǔn)”相同的操作框架適用于多種菌，只需選擇合適內(nèi)切酶、優(yōu)化電泳條件即可。技術(shù)特點(diǎn)PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置參數(shù)設(shè)置脈沖時(shí)間電場夾角電場強(qiáng)度電泳溫度緩沖液組成瓊脂糖類型和濃度PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置

脈沖時(shí)間是指電場在某個(gè)角度持續(xù)的時(shí)間。脈沖場電泳的核心參數(shù)。通常實(shí)驗(yàn)中使用的脈沖時(shí)間為一個(gè)范圍值，如：2－20S。脈沖時(shí)間的變換可以是線性的或者是非線性的。與電泳時(shí)間作區(qū)別，電泳時(shí)間通常為20hr左右，其根據(jù)是標(biāo)準(zhǔn)菌種H9812的20Kb片段距膠的下緣為1-1.5cm.脈沖時(shí)間分離不同大小DNA

改變脈沖時(shí)間PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置脈沖時(shí)間—不同脈沖時(shí)間對帶型的影響2.2-54.2s2-30s2-35s2-25s隨著脈沖時(shí)間上限的縮短大片段DNA的位置越來越靠近上端加樣孔，同時(shí)小片段也得到了充分的分離。PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置隨著電場夾角的減小，兩個(gè)大片段DNA分離的更好。但同時(shí)小片段也在逐漸的壓縮。所以為了兼顧不同大小的片段需要選擇一個(gè)合適的電場角度。120°100°105°96°94°2.2Mb1.6Mb電場夾角PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置電場夾角使用較小的電場夾角可以分離較大的DNA片段，反之較大的電場夾角用來分離較小的片段。當(dāng)使用較小的電場夾角時(shí)，小片段會(huì)變的相對集中。FieldAFieldBReorientationAngle120°大部分基于CHEF脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場夾角為120?PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置電場強(qiáng)度A.電場強(qiáng)度以V/cm來表示的。B.大部分基于CHEF脈沖場凝膠

電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電

場強(qiáng)度為6V/cm。C.使用較高的電場強(qiáng)度可以分離

較大的DNA片段，反之亦然。3V/cm6V/cm9V/cmPFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置電泳溫度通過冷凝以及循環(huán)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對電泳緩沖液的溫度控制。B.較高的溫度會(huì)造成條帶彌散，影響分辨率。C.通常使用的緩沖液的溫度為12℃－15℃。標(biāo)準(zhǔn)化溫度定為14℃.PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置緩沖液類型緩沖液選擇：緩沖液的緩沖能力以及長時(shí)間電泳后液體的損耗問題。通常緩沖液包括兩種0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB級DNA片斷的分離（>3MB），而0.5XTBE常用于<1MB的片斷的分離。0.5XTBE1.0XTAEPFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置瓊脂的種類以及瓊脂的濃度使用的瓊脂糖濃度越低，所能分離的DNA片段越大。但瓊脂濃度低時(shí)其機(jī)械強(qiáng)度也低，實(shí)驗(yàn)操作難度也難免會(huì)加大。使用的瓊脂糖應(yīng)當(dāng)具備以下的特點(diǎn)：1、機(jī)械強(qiáng)度大，利于實(shí)驗(yàn)操作2、純度高，可提高電泳的分辨率3、熔點(diǎn)低，包埋細(xì)菌時(shí)凝膠的溫度不易過高標(biāo)準(zhǔn)化操作中使用SeaKemGold(SKG)瓊脂糖PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置方法標(biāo)準(zhǔn)化PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置實(shí)驗(yàn)流程細(xì)菌培養(yǎng)菌體裂解膠塊洗滌DNA酶切加樣電泳結(jié)果處理細(xì)菌培養(yǎng)制備膠塊第一天第二天第三天PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置2)digestCellularProteinProteinaseKAgarose1)EmbedCellsinAgaroseDNA膠塊的制備：用瓊脂糖將細(xì)菌包埋，避免染色體DNA的機(jī)械性損傷。實(shí)驗(yàn)流程細(xì)菌的裂解：蛋白酶K水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白。PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置3)DigestGenomicDNARestrictionEnzyme16hr4)LoadPlugintoAgaroseGelandSeparate(Sideviewofagarosegel)實(shí)驗(yàn)流程膠塊中DNA的酶切：寡切點(diǎn)酶片段少而大片段數(shù)目（＞10，＜25~30）酶切片段的電泳PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置5)StainGelandVisualizeBandPatterns6)BandPatternsareDigitizedandaddedtoadatabaseforanalysis實(shí)驗(yàn)流程圖像的獲?。篋NA指紋圖譜EtBr或GelRed染色BioNumerics軟件作聚類分析PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置在使用細(xì)菌分型的結(jié)果進(jìn)行暴發(fā)研究時(shí)是基于以下幾個(gè)假設(shè)的：1.屬于一次暴發(fā)的分離株來源于同一個(gè)祖先2.這些菌株應(yīng)該具有相同的基因型3.流行病學(xué)無關(guān)的菌株應(yīng)該有不同的基因型別細(xì)菌分型原理菌株分型的目的是為了提供實(shí)驗(yàn)室角度的證據(jù)。這一證據(jù)支持那些分離自一次暴發(fā)中分離的流行相關(guān)（epidemiologicallyrelated）菌株，同時(shí)也是遺傳相關(guān)的（geneticallyrelated）菌株，從而證明這些菌株是同樣的菌株。PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置基因事件與條帶變化75kb100kb200kb400kb500kb獲得失去插入缺失PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置無法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株為同

一菌株。高度相關(guān)：如果PFGE帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些菌株

就被定義為高度相關(guān)菌株。這些僅有兩到三個(gè)條帶變化的情況常

見于反復(fù)傳代以及從同一病人中多次分離的菌株?？赡芟嚓P(guān)：PFGE帶型與暴發(fā)菌株帶型變化有兩個(gè)獨(dú)立的基因事件引起的條

帶變化（通常是4到6個(gè)條帶的變化）。這些分離株可能是遺傳

上相關(guān)的，但是并不是緊密相關(guān)的，其流行病學(xué)關(guān)系也并不緊密。這樣的突變常見于分離自較長的時(shí)間段（大于等于6個(gè)月）或者

是大規(guī)模延伸暴發(fā)的病人中。無關(guān)：三個(gè)獨(dú)立的基因事件引起的條帶變化（7個(gè)或者是以上的條帶變化）。TENOVER原則PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置TENOVER原則的聚類方法首先，檢查所有的帶型，確定能否發(fā)現(xiàn)一個(gè)暴發(fā)帶型或者代表帶型。如果沒有發(fā)現(xiàn)代表帶型，那么這些分離株很可能是流行病學(xué)無關(guān)菌株。（流行相關(guān)的菌株中沒有代表帶型的情況是小概率事件）。其次，以暴發(fā)帶型為基礎(chǔ)和其他分離株的帶型進(jìn)行比較。應(yīng)該確定每個(gè)帶型與暴發(fā)帶型的關(guān)系。帶型差異超過50%的分離株可以認(rèn)為是暴發(fā)無關(guān)分離株。而那些與暴發(fā)帶型只有2到3個(gè)條帶差異的分離株被認(rèn)為是暴發(fā)帶型的衍生。PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置聚類分析只有帶型相似性在100%的菌株才可能是暴發(fā)菌株。PFGE分型技術(shù)原理及標(biāo)準(zhǔn)儀器配置

菌株分型研究不能代替流行病學(xué)研究，要將流行病學(xué)資料分析研究應(yīng)作為基礎(chǔ)。兩項(xiàng)工作雖分別進(jìn)行，但是要綜合在一起進(jìn)行分析才能確定是否真正存在著暴發(fā)。PFGE作為暴發(fā)菌株的鑒定是一種有效的方法，然而一旦收集菌株的時(shí)間跨度超過三到六個(gè)月，分型研究就轉(zhuǎn)化為種群研究。另外一些技術(shù)，如MLST，主要用于監(jiān)測微生物種群隨時(shí)間變化的特點(diǎn)。管家基因的突變是中性突變，不受環(huán)境選擇壓力的影響。近來，這兩種方法經(jīng)常被結(jié)合起來用于細(xì)菌的分型研究，有助于我們弄清楚暴發(fā)菌株是如何擴(kuò)散的，以及各細(xì)菌種群是如何隨時(shí)