SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

1精選2021版課件

SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)之一。

2精選2021版課件

能夠帶動(dòng)生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合型實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)。

如：蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取→葡聚糖凝膠層析分離→DEAE-纖維素分離提純蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)純度鑒定、蛋白質(zhì)分子量測(cè)定等。3精選2021版課件一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理；掌握該技術(shù)的操作方法（基礎(chǔ)性很強(qiáng)，使用范圍寬闊；運(yùn)用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。4精選2021版課件二、實(shí)驗(yàn)原理

帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳分類：移動(dòng)界面電泳、區(qū)帶電泳等。區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質(zhì)上加一個(gè)點(diǎn)或一薄層樣品溶液，然后加電場(chǎng)，分子在支持介質(zhì)上或支持介質(zhì)中遷移。5精選2021版課件

區(qū)帶電泳使用不同的支持介質(zhì)，有濾紙、纖維素粉、聚氯乙烯樹脂、淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。

6精選2021版課件

（一）分類

PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：

1.連續(xù)系統(tǒng)：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。

7精選2021版課件2.不連續(xù)系統(tǒng)：由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。8精選2021版課件

（二）特點(diǎn)：

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）。

9精選2021版課件

蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，10精選2021版課件蛋白質(zhì)分子移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15000KD到200000KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。合下式：，式中

將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

11精選2021版課件圖1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜

圖2電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系

940006200043000310002010014400膠槽123注：膠槽1標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3樣品蛋白得到同行專家贊12精選2021版課件采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，必須完全打開蛋白質(zhì)之間的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上。因此在用SDS處理樣品同時(shí)用巰基乙醇處理。巰基乙醇是一種強(qiáng)還原劑，它使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。13精選2021版課件三、實(shí)驗(yàn)試劑和器材

材料

實(shí)驗(yàn)試劑

1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒:兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動(dòng)蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

開封后溶于200μl蒸餾水，置-20℃保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。

樣品1：稱3mg樣品1，加2ml蒸餾水溶解。14精選2021版課件

2.30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過(guò)濾后置棕色瓶中

3.10%SDS（十二烷基磺酸鈉）

4.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g（PH計(jì)）15精選2021版課件（7）10%過(guò)硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加上述固定液

250ml，過(guò)濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

16精選2021版課件實(shí)驗(yàn)器材

垂直板電泳裝置直流穩(wěn)壓電源電泳厚膠濃度后要做8各小時(shí)，薄膠5各小時(shí)）電泳儀標(biāo)準(zhǔn)型酸度計(jì)（TLD80-2B）離心機(jī)等17精選2021版課件四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程

如：免疫球蛋白G分子量的測(cè)定

（一）血清γ-球蛋白的提取

硫酸胺鹽析沉淀法

（二）γ-球蛋白脫鹽純化

葡聚糖凝膠過(guò)濾（柱層析法）除去硫酸胺，得到γ-球蛋白（去年完成的基金項(xiàng)目）

（三）純化免疫球蛋白G

DEAE-離子交換纖維素法純化免疫球蛋白G。

（四）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定血液免疫球蛋白G的分子量（連續(xù)四個(gè)單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)）。

18精選2021版課件

（1）制膠（簡(jiǎn)單敘述）（雙層膠，摸索膠濃度）

A.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準(zhǔn)備2個(gè)干凈的錐形瓶。把玻璃板在灌膠支架上固定好。B.按比例配好分離膠，溶液立即傾入制膠模板中(15ｍｍ模板)，加少許蒸餾水，待膠凝固后，倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處，樣梳需一次平穩(wěn)插入，靜置40分鐘，待模板中的膠定型后，輕輕取出梳形樣品槽模具，梳口處不得有氣泡，拔出樣梳后，在上槽內(nèi)加入緩沖液。

19精選2021版課件

C.拔出樣梳后,在上槽內(nèi)加入緩沖液,

D.加樣（摸索加樣量）

取10μl標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶解液于EP管內(nèi)，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量為20μl。

取10μl樣品溶液，再加入10μl2倍樣品緩沖液，上樣量分別為5μl和10μl。

E.用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣,加樣前,樣品在沸水中加熱3分鐘，去掉亞穩(wěn)態(tài)聚合。

20精選2021版課件

F.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在8mA，（電流、電壓）當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為16mA，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停止電泳。

G.凝膠板剝離與染色電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色過(guò)夜。

H.脫色染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色。

※剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分。21精選2021版課件圖1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與待測(cè)樣品電泳圖譜

圖2電泳遷移率與logMW之間的關(guān)系

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

940006200043000310002010014400膠槽123注：膠槽1標(biāo)準(zhǔn)蛋白；膠槽2、3樣品蛋白22精選2021版課件六、分析計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：按下式計(jì)算

電泳遷移率=樣品遷移距離/溴酚籃遷移距離

以每個(gè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測(cè)出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對(duì)同一塊凝膠上的樣品的分子量測(cè)定才具有可靠性。23精選2021版課件

標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量（標(biāo)準(zhǔn)試劑盒）：

97400kD、66200kD、43000kD、31000kD、20100kD、14400kD。

采用不連續(xù)SDS電泳法對(duì)所分離純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定，發(fā)現(xiàn)圖中電泳圖譜可以清晰的看到兩條蛋白帶。24精選2021版課件

兩條蛋白帶代表綿羊免疫球蛋白G的重鏈和輕鏈。

計(jì)算分析結(jié)果表明：

綿羊血清lgG重鏈和輕鏈的分子量分別為50000和28000Kd。一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在200000至15000kD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果各譜帶所代表的成分的分子量的范圍均在此之間。用SDS垂直板電泳測(cè)得綿羊血清具有一定的可信度。

25精選2021版課件七、思考題在不連續(xù)體系SDS中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么?在不連續(xù)體系SDS中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用?樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?26精選2021版課件十二、達(dá)到預(yù)期目標(biāo)

1.SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)是動(dòng)物生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)中一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，且是一個(gè)較高水平的一個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。27精選2021版課件

蛋白質(zhì)鹽析沉淀提取→凝膠層析分離（上年基金項(xiàng)目已完成）→DEAE-纖維素分離提純蛋白質(zhì)→蛋白質(zhì)分子量測(cè)定、生物分子純度鑒定等綜合項(xiàng)目（五個(gè)單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目）。28精選2021版課件

2.該項(xiàng)目的完成對(duì)我們課程的建設(shè)起到了促進(jìn)發(fā)展的作用，達(dá)到了我們預(yù)期目標(biāo)。

29精選2021版課件3.該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)，使學(xué)生掌握了利用聚丙稀酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)、SDS—PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的基本理論及實(shí)驗(yàn)技術(shù)。