抗氧化活性研究方法

抗氧化活性研究方法以酶標法去除DPPH自由基為主整理課件目錄一.檢測抗氧化活性的原因二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性三.檢測方法四.DPPH法〔原理，一般方法，酶標法〕五.ABTS法六.TBARS法七.鐵離子復(fù)原能力(FRAP)一.檢測抗氧化活性的原因

1.天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性2.抗氧化劑有延緩衰老等成效，越來越受到人們關(guān)注3.據(jù)文獻記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.抗氧化活性測試簡單，快捷，經(jīng)濟

二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑自由基對人體造成的傷害天然植物三.檢測方法目前常用的抗氧化活性檢測方法主要基于以下機理：(1)在特定條件下，樣品對檢測體系中脂類物質(zhì)的氧化抑制能力反映被測物的抗氧化活性；〔TBARS法〕(2)在特定條件下，樣品對檢測體系中自由基的去除能力反映被測物的抗氧化活性；〔DPPH自由基的去除〕(3)在特定條件下，測定樣品的復(fù)原能力反映被測物的抗氧化活性。〔復(fù)原Fe3+〕

四.DPPH法1.原理DPPH(二苯代苦味?；杂苫?是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基。特點：醇溶液呈紫色，波長為517nm下具有最大吸收。具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，有自由基去除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降,吸光度水平的降低說明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化性越強。實驗步驟

2.實驗步驟〔1〕酶標法檢測——酶標儀取96孔細胞培養(yǎng)板，各孔分別參加150μmol·L-1的DPPH溶液180μL,各濃度梯度樣品溶液20μL,終濃度分別為3.9~500μmol·L-1，反響總體積200μL,以溶劑作對照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在10~120min時間范圍內(nèi)于517nm處測定各孔吸光度值。觀察樣品抗DPPH的時效量效變化過程，確定實驗的穩(wěn)定性和最正確實驗反響時間。計算公式為:去除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A〔溶劑〕x100％VitE去除DPPH自由基抗氧化量效曲線10-120min內(nèi),隨著作用時間的延長VitE抗DPPH作用增強，但在3.9-31.2μmol·L-1范圍內(nèi)，各時間點的藥效變化不明顯，62.5-500μmol·L-1濃度范圍，隨著濃度增加，各時間點的藥物作用曲線逐漸別離，并在500μmol·L-1，各時間點量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時間點中，30min的量效曲線根本呈斜線上升。30minVitE去除DPPH自由基抗氧化量效曲線反響時間t為30min的量效曲線〔相關(guān)系數(shù)〕實驗步驟〔2〕一般方法——紫外分光光度計法將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品參加3.5mLDPPH甲醇溶液(0.06mmol/L)，混合30min后測定515nm處吸光度。每份樣品平行操作3次。

計算公式為:去除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A〔溶劑〕x100％酶標法優(yōu)勢3.酶標法優(yōu)勢抗氧化微孔板實驗方法的優(yōu)勢：①耗材量少，試劑量以微升計；②試劑種類少，局部試劑配制可交互使用；③方法簡便，耗時短；④可重復(fù)性強，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。五.ABTS法

1.原理以水溶性的ABTS+自由基引發(fā)劑為顯色劑。特點：ABTS與過硫酸鉀反響生成穩(wěn)定的藍/綠色陽離子自由基ABTS+，最大吸光波長為734nm。向ABTS+其中參加被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，那么該物質(zhì)會與ABTS+發(fā)生反響而使反響體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的734nm吸光波長下檢測吸光度的變化來反映物質(zhì)的抗氧化能力。實驗步驟

2.實驗步驟將樣品用甲醇配制成一系列濃度,取0.15mL樣品參加2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm處測定吸光度。每份樣品平行操作3次。計算公式為：去除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A〔溶劑〕×100％A〔溶劑〕為2.85mLABTS溶液與0.15mL甲醇混合后的吸度，A〔樣品〕為2.85mLABTS溶液與0.15mL樣品混合后的吸光度。

ABTS法優(yōu)缺點3.優(yōu)缺點簡便，快速，適合于大量樣品的檢測。ABTS在與氫原子供體的反響中選擇性差是此法的一個缺乏，它可與任何羥基化的芳香族化合物反響，這與它們的實際抗氧化能力關(guān)，因此,TEAC值也包括對抗氧化不起作用的羥基。六.TBARS法簡介脂質(zhì)體系中氧化反響抑制或中止的判斷主要通過測量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因此，反響物(不飽和脂肪酸，自由基等)的消失，氧化產(chǎn)物的定量可能是判斷氧化階段的最適宜方法。通過直接或者間接檢測氧的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過程的初始階段。通常采用TBARS法來評價脂質(zhì)的過氧化.七.鐵離子復(fù)原能力(FRAP)原理FRAP的原理是基于氧化復(fù)原反響的比色法。在酸性條件下，F(xiàn)e3+一TPTA(Fe3+—三吡啶三嗪)