資助類別亞類說明版面上項目proposal

國家自然科學基書（2015資助類別亞類說明附注說明項目名稱依托單位通訊地址廣州市越秀區(qū)沿江西路107郵國家自然科學基書（2015資助類別亞類說明附注說明項目名稱依托單位通訊地址廣州市越秀區(qū)沿江西路107郵政編碼單位電話02084111595、電子郵箱申報日期2015年03月05版本第1 男 每年工作時間（月 廣州市越秀區(qū)沿江西路107 版本第1 男 每年工作時間（月 廣州市越秀區(qū)沿江西路107 StudyonFunctionofHedgehogsignalingpathwayduringliverregenerationanditspotentialapplicationinfutureclinic2016年012019年12liverregeneration;sub-acutehepaticinjury;Hedgehogsignalingpathway;hepatocytestransplant;fumarylacetoacetatehydrolase(Fah)版本第2版本第2模型，研究亞急性肝損傷引起的肝再生中Hedgehog(Hh)信號通路激活與增殖肝實質(zhì)細胞在肝Liverregenerationistheprocessofliverreconstructionandrestorationaftervariousliverinjuriesinducedbymechanicaldamage,toxicationandvirusinfection.Recently,activationofHedgehog(Hh)pathwayhasbeenfoundduringpartialheptectomy-inducedliverregeneration.However,duetothelimitsofthismodelsystem,pathologicalinjury-inducedliverregenerationsarestillpoorlyunderstood.Inthisproposal,wewilluseFah-/-mouse,atyrosinimiarelativeliverinjury-inducedliverregenerationmodelsystem,tostudythefunctionofHhsignalingpathwayduringliverregenerationandtestitspotentialforfutureclinicapplication.Inpreliminarystudy,wehavefoundsomeuniquefeaturesofHhpathwayactivationduringliverrepopulationinFah-/-mouse.Inthisproject,weproposetheplanforcontinuedinvestigation;First,wewillbroadlystudythedetailsofactivationofHhsignalingpathwayduringtheprocessofliverrepopulationoftransplantedhepatocytesinFah-/-mouse.Second,wewillevaluatewhethertheinhibitorsofHhsignalingpathwaycanblocktheliverrepopulationofhepatocytesinFah-/-mouse.Finally,wewilltestwhethertheup-regulationofHhsignalingpathwaycanfurtherpromotetheliverregenerationinsub-acutehepaticinjury.Ourstudywillsupplynewinformationforapplicationofliverregenerationintofutureclinicandforfindingthetargetsofdruginscreeningtocontrolliverregeneration.項目組主要參與者（項目組主要參與者不包括項目申請人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7項目組主要參與者（項目組主要參與者不包括項目申請人版本第392210041男0471-82男020-83男0471-94男020-5男0471-6男020-7男020-8男020-國家自然科學基金項目資金預算表（定額補助項目名稱：Hedgehog版本第41/231456728394567國家自然科學基金項目資金預算表（定額補助項目名稱：Hedgehog版本第41/23145672839456791011預算說明本項目申請經(jīng)費80預算說明本項目申請經(jīng)費8066.666713.3333（一）66.66671.：02.材料費：41.6667材料四：RNA-pulldown，0.5萬元/個，需6個，共計3材料五：MagnaRIPTMRNA-BindingProteinImmunoprecipitationKit：材料七：購買普通shRNA0.3萬元/份，需5份，共計1.5萬元。材料九：SleepingBueaty試劑：1萬元/份，需8份，共計8萬元。材料十：LipofectamineTMRNAiMAX：0.4萬元/份，需6份，共計2.4材料十二：實驗動物BALB/c裸鼠0.01萬元/只，需100只，共計1萬元。其他：實驗動物飼養(yǎng)費用0.0003元/只/天，共100只×100天，共計3萬元。檢測項目四：Deletionmapping，1萬元/次，需5次，共計5差旅費：1.5萬元。（參加肝再生學術交流會議6人次，每人次0.25萬元，共計1.5萬元0，約1萬元專家咨詢費：0.5萬元。（研究期間邀請專家咨詢，擬邀請5人次。專家咨詢費1000元/天×1天×5人×1次=0.5萬元11.：0（二）：13.3333版本第5（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-字1（研究國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-字1（研究國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析獻目錄肝再生是肝臟損傷后肝內(nèi)細胞增殖重建肝臟的過程。引起肝的損傷誘因是多方面的，包括肝臟的直接機械損傷，中毒、病毒侵以及各種肝臟疾病[1]。肝再生通過激活肝內(nèi)細胞（包括肝實質(zhì)細胞膽管上皮細胞、內(nèi)皮細胞、枯否細胞等）增殖重建肝臟組織達到肝功能的恢復3]。因為肝再生與臨床治療緊密相關，對機理的深入研究，將有助于利用肝再生最終為臨床的治療服現(xiàn)有的對肝再生的認識建立在部分肝切除模型，人們在過去十年中對肝再生過程的機制進行了深入研究5]。近期指出[6]，Hedgehog(Hh)信號通路激活參與了在小鼠70％部分（PH）后肝臟再生過程（公認的成年人肝臟再生模型肝切除誘再生過程肝內(nèi)Hh配體表達增Hh信號通路的成激活，體現(xiàn)在他們本身的表達加強，表達后活動加強。這個發(fā)現(xiàn)提了信號通路的激可能對肝再生的發(fā)生和調(diào)控起主導作用也進一步提示，對 信號通路的激活將有助于實現(xiàn)對肝再生的控[8]，從而有助于肝再生臨床工作中的應用。然而，利用部分肝切除型研究所獲得的結果得出的結論還沒有證明具有普遍意義。這是因引起肝再生的損傷誘因是多方面括肝臟的直接機械損傷版本第6病毒侵染以及各種肝臟疾病。在基礎研究中，針對肝損傷誘導肝再模擬的動物病毒侵染以及各種肝臟疾病。在基礎研究中，針對肝損傷誘導肝再模擬的動物模型有幾種類型部分肝切除模型只是其中的一種于研究肝切造成的肝損傷誘導再生的模型，是有局限性的。近期，應有其他的肝再生研究模型的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了(Hh)號通路的激活在不同的研究模型誘發(fā)的肝再生中存在不同的激活因此(Hh)信號通路進一步廣泛深入的研究，將獲得(Hh)更加全面的認識，為臨床應用打下良礎肝再生動肝再生動物模型的不同，對肝再生機制的研究有重要影響肝再生研究中所運用的動物模型主要為嚙齒類的大鼠和小鼠，根據(jù)發(fā)肝損傷的類型可劃分為三類第一類：手術誘導肝損傷模型。主要通過部分肝切除、門靜支結扎等方法誘導肝再生[10]。其中部分肝切除一直是肝再生主要的研究模型。該模型做為肝再生模型具有顯著的優(yōu)勢：一、容操作，容易標準化，結果容易重復[11]；二、肝實質(zhì)細胞增殖致，易于研究[9]；三、研究基礎深厚。但值得注意的是，該模型依有諸多不足：一、肝再生過程快速啟動并快速完成，有些信號轉瞬逝，難以捕捉；二、理論上肝實質(zhì)細胞僅需1.66次增殖即可完成生，而臨床上肝再生往往需要肝實質(zhì)細胞的連續(xù)大規(guī)模擴增；三、臨床常見的肝再生情況不同，該模型無明顯肝實質(zhì)細胞的損傷，且余肝臟組織結構沒有破壞，免疫系統(tǒng)參與較少9]版本第7第二物誘導肝損傷主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等藥物引起肝損傷后誘導肝再生。藥第二物誘導肝損傷主要CCl4D-galactosamineacetaminophen、等藥物引起肝損傷后誘導肝再生。藥物誘導的再生被認為與臨床中常見的肝再生情況更為接近[9類模型往往于肝實質(zhì)細胞的大量壞性粒巨噬細胞浸潤清除死亡而剩余肝實質(zhì)細胞連續(xù)大量增殖重建肝臟[12]。其肝再生過程更接疾病和中毒引起的肝損傷后肝再生過程。但這類模型非常依賴藥物劑量、給藥方式、動物年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、代謝酶活性等[13]。個異對實驗結果影響巨大，導致這類模型難以標準化，實驗結果較難復第三類：基因工程誘導肝損傷模型。主要有延胡索酰乙酰乙解酶缺失（Fah-/-）引起的肝實質(zhì)細胞損傷動物，通過外源肝實質(zhì)細移植實現(xiàn)肝再生本項目采用的（Fah-/-I酪氨酸血癥模型[14]Fah基因缺失時，氨酸代謝通路的延胡索酰乙酰乙酸不能水解，使得有毒的代謝中間物延胡索酰乙酰乙酸和順丁烯二酸單酰乙酰乙酸在肝實質(zhì)細胞中大積累，導致肝實質(zhì)細胞死亡，從而引起肝衰竭。Fah-/-小鼠比I酪氨酸血癥患者有更嚴重的肝損傷，會導致小鼠出生后死亡。但治人I氨酸血癥NTBC可阻斷酪氨酸代謝通路。如小鼠喂食NTBC水，小鼠將正常存活[14]。一NTBC，F(xiàn)ah-/-將因肝衰竭死如果通過細胞移植方法將肝實質(zhì)細胞移植小鼠肝臟中，同時撤NTBC，外源肝實質(zhì)細胞將再生并重建小結構和功能[15]版本第8圖1.Fah-/-小鼠作為肝實質(zhì)細胞移植后再生模型。A.F圖1.Fah-/-小鼠作為肝實質(zhì)細胞移植后再生模型。A.Fah-/-小鼠酪氨酸代謝途徑因Fah基因缺失被阻斷。Maleylacetoacetate和Fumarylacetoacetate會引起肝實質(zhì)細胞損傷并死亡。而NTBC可阻斷酪氨酸代謝途徑，防止產(chǎn)生有毒代謝中間產(chǎn)物。B.Fah-/-小鼠依賴NTBC存活。撤NTBC將導致小鼠因肝衰竭死NTBC的生，并重建肝臟的結構和功能Fah-/-小鼠模型是基于外源肝實質(zhì)細胞在肝再生機制的作用下整合到受體小鼠肝臟中再植實現(xiàn)重建肝臟的結構和功能。因為肝實細胞Fah-/-小鼠中的再植集中反映肝再生中的肝實質(zhì)細胞活動的全貌，結合該模型更接近臨床病理情況的優(yōu)點，和便于對肝實質(zhì)細在再生中的定量分析的優(yōu)點，我們在本研究中將能夠以外源肝實質(zhì)胞Fah-/-小鼠中的再植作為研究目標，把研究集中細胞的活動特點，以闡明通路促進肝實質(zhì)細胞Fah-/-小鼠作為肝再生模型以下優(yōu)勢：一、易于操作，于標準化，結果容易重復；二、與疾病引起的肝損傷情況類似，更版本第9近臨床；三、增殖的外源肝實質(zhì)細胞與受損的肝實質(zhì)細胞易于區(qū)分可通近臨床；三、增殖的外源肝實質(zhì)細胞與受損的肝實質(zhì)細胞易于區(qū)分可通過細胞移植攜帶其他基因或shRNA等研究工具，方便研究肝實質(zhì)細胞會連續(xù)發(fā)生大規(guī)模的肝再生過程長達數(shù)個星期易于捕捉肝再生不同階段的事件。之前在肝切模型中，人們就發(fā)現(xiàn)胞外基質(zhì)的降解與重建對肝再生有重要作用其調(diào)控過程非常迅速往往在幾分鐘內(nèi)就能完成調(diào)控，使得對細胞外基質(zhì)的研究十分困難而Fah-/-小鼠模型細胞外基質(zhì)的調(diào)控過程長達數(shù)天甚至幾個星期，得我們可以對其調(diào)控的機制進行深入研究[16]。Fah-/-小鼠世界上僅有少數(shù)實驗室只有少數(shù)實驗室建立了完整Fah-小鼠研究系統(tǒng)。人們對其肝再生的機制研究還比較少。我們實驗室于申請人過去6年使用Fah-/-小鼠的研究經(jīng)驗，已經(jīng)建立了完Fah-/-小鼠研究系統(tǒng)。我們準備充分發(fā)揮我們的優(yōu)勢進行研Hh信號通路在肝切損傷誘導出的肝再生的現(xiàn)有Hedgehog基因1980先由Nuslein-VolhardC在對篩選能引起果蠅突變的基因時發(fā)現(xiàn)[17]。哺乳動物中存在三個的同源基因：SonicHedgehog(SHH)、 Hedgehog(IHH)和Hedgehog(DHH)，分別編碼Shh、Ihh和DhhHh白通過修飾才能獲得完全功能Smoothened(Smo)及通路下游的類運動蛋白(Cos2)、絲氨白激酶(Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、蛋白A(PKA)、Hedgehog用蛋白(Hhip),哺乳動物中Gli1、Gli2、Gli3等多種蛋白。Ptch是次跨膜蛋白,在人2個同源基因：Ptch1和Ptch2結合;Smo7膜蛋G偶聯(lián)型受體同源,負責細胞內(nèi)信版本10傳導及靶基因的活Gli蛋白家族成員是較大的多功的轉錄因傳導及靶基因的活Gli蛋白家族成員是較大的多功的轉錄因PKA起負調(diào)控Hhip是僅存在于脊椎動物體內(nèi)高度保守的Hh相互作用蛋白,作為抑制因子Hhip能夠Ptch的結合HhHh配體喪失Hh信號通路的功能[19肝再生過程是一個嚴格有序的過程。肝實質(zhì)細胞的增殖和增肝實質(zhì)細胞的有序構建肝組織使得肝再生過程嚴格受控，明顯不同肝癌細胞在肝臟中成瘤生長[2,20,21]。在肝再生的過程中肝非細胞參與調(diào)控了對肝實質(zhì)細胞調(diào)控[22]，最近的報道指出，成性肝損傷后出現(xiàn)刺猬（Hh）配體和發(fā)育形態(tài)發(fā)生因子的增加，這些子在胚胎發(fā)育過程中控制祖細胞分化和調(diào)節(jié)各方面組織生長[23]提示 信號通路也可能調(diào)節(jié)成年人肝臟再生。在小鼠肝切引起的再生模型中肝切除誘導肝細Hh配體增Hh信號通路。用定的 信號抑制劑干擾正常肝再生的幾個關鍵組件，顯著抑制了細胞反應、基質(zhì)重塑、肝細胞膽管細胞增殖和肝體積恢復[24]臟再生的這些全面抑制作用顯著降低小鼠肝切除后的生存率。所以節(jié)肝臟發(fā)育的機制如 通路的激活，將有可能維持和促進成人肝損傷后的肝再生，這是本課題申請的意義所在。為將來臨床肝再礙性疾病（包括各種原因的肝硬化、肝切除后肝功能不全/種肝炎導致肝衰竭治療提供試驗在先期的研究中，應用外源肝實質(zhì)細胞在Fah-/-小鼠模植作為研究目（見本課題申請研究基礎部分我們的發(fā)現(xiàn)版本11前期報道中對(Hh)信號通路激活在作用于促進肝再作用，前期報道前期報道中對(Hh)信號通路激活在作用于促進肝再作用，前期報道認為Hh配體作為肌纖維母肝細胞的生長因子，刺激止期肝星狀細胞獲得肌纖維母細胞表型，并誘導未成熟膽管EMT[25]。因此，Hh通路的活化促進慢性肝損傷的纖維化修復反應不同于這個前期報道，我們研究團隊認為，Hh通路激活能促進肝臟細胞的生長，有助于替換死亡的成熟肝細胞。我們的發(fā)現(xiàn)與最近的一篇報道的發(fā)現(xiàn)是吻合[23]3）Hh信號通路肝再生健康成人肝臟有巨大的再生能力。這使得人在接受70切除（PH）后數(shù)周內(nèi)恢復正常的肝功能和肝質(zhì)量。嚙齒動物的肝再進行得更迅速，PH后7至10天就能完成肝臟所以嚙齒動物經(jīng)用來作為研究肝再生機制的實驗模型。研究表明PH后的初始48細胞DNA合成劇烈增加，伴隨（但高度顯著）肝細胞有絲分裂和肝臟量的增加，所以認為PH后的肝再生很大程度上依賴于成熟肝細胞的加的復制28]。最近的研究已經(jīng)證明，Hedgehog信號傳導肝切除術后激活[7Hh體通常促進祖細胞的生長和存活，并出對人類和嚙齒類動物的肝臟祖細胞有促進生長的功能，包括卵圓胞[29]。在胚胎發(fā)育和腫瘤轉移過程中，Hh路的激活擴增基質(zhì)細胞數(shù)量，通過保留現(xiàn)有間充質(zhì)細胞原始的、遷徙的表型和在幼稚的上細胞中促進上皮－間質(zhì)轉變（EMT版本12既往的研究沒有闡明Hh是如何釋放出來的。即是什么細胞在除的再既往的研究沒有闡明Hh是如何釋放出來的。即是什么細胞在除的再生過程中釋放了Hh在損傷后的肝否同樣是這些細胞我們所利用的Fah基因敲除的肝損傷模型與肝切除模型相比有程度和損傷的時間可控制的優(yōu)點，將利于我們研究操作后Hh釋放胞。Hh作用于肝再生中的靶細胞，前期研究發(fā)表的結果提示可能的細胞為星型細胞的前體我們將首先觀察在Fah損傷模型也是同樣的細胞，下一步我們將深入研究Hh是否直接做用于肝實質(zhì)胞上。這是因為Hh是刺激肝細胞數(shù)目的增多，有可能Hh直接作用實質(zhì)上發(fā)揮促進實質(zhì)細胞增殖的作用。在肝再生過程中細胞與細胞相互作用激活調(diào)控肝實質(zhì)細胞的肝組織重建活動，已知的Hh信號參與肝再生的調(diào)控機理認識還沒有真正搞清楚，現(xiàn)有的研究存在兩最大的問題：I，本領域長期普遍認為，在急性肝損傷引起的肝再生程中主要活動是成熟的肝實質(zhì)細胞的激活增值和組織構建然不能排除誘導和激活和肝內(nèi)干細胞的分化增值，但肝內(nèi)干細胞的活參與為非主要活動31]，而最新報道文章的觀點卻損傷引起的肝再生過程中星形細（HSC）干細胞被激活并分化為肝質(zhì)細胞是主要的33]。II，先前的文章研究所用的肝性肝損傷引起的肝再生對于另外兩類的肝再生模型中Hh的是否一尚待研究。為了研究這兩個問題，我們在近期建立了與內(nèi)蒙古大學欣教授的合作，并獲得了充實前期的實驗結果，為此基金的研究打了良好基礎版本13Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.,Liverregeneration.JournalofCellularPhysiology,2007.213(2):p.Michalopoulos,G.K.andM.C.DeFrances,Liverregeneration.Science,1997.276(5309):p.DeLeve,L.D.,Liversinusoidalendothelialcellsandliverregeneration.JClinInvest,123(5):p.1861-Kuramitsu,K.,etal.,Carbonmonoxideenhancesearlyliverregenerationinmiceafterhepatectomy.Hepatology,2011.53(6):p.2016-26.Ogasawara,T.,etal.,BeneficialeffectsofKampomedicineInchin-ko-toonliverfunctionandregenerationafterhepatectomyinrats.HepatolRes,2008.38(8):p.818-24.Ochoa,B.,etal.,Hedgehogsignalingiscriticalfornormalliverregenerationafterpartialhepatectomyinmice.Hepatology,2010.51(5):p.1712-23.Hanaoka,J.,etal.,SignificanceofsonichedgehogsignalingaftermassivehepatectomyinaOmenetti,A.,etal.,Hedgehogsignalingintheliver.JHepatol,2011.54(2):p.366-Palmes,D.andH.U.Spiegel,Animalmodelsofliverregeneration.Biomaterials,2004.25(9):p.Mortensen,K.E.andA.Revhaug,Liverregenerationinsurgicalanimalmodels-ahistoricalperspectiveandclinicalimplications.EurSurgRes,2011.46(1):p.1-18.Gonzales,E.,etal.,ATPreleaseafterpartialhepatectomyregulatesliverregenerationintherat.JHepatol,2010.52(1):p.54-62.Michalopoulos,G.K.,LiverRegenerationafterPartialHepatectomyCriticalAnalysisofMechanisticDilemmas.AmericanJournalofPathology,2010.176(1):p.2-13.Diehl,A.M.,Nutrition,Hormones,Metabolism,andLiver-Regeneration.SeminarsinLiverDisease,1991.11(4):p.315-320.Grompe,M.,etal.,PharmacologicalCorrectionofNeonatalLethalHepatic-DysfunctioninaMurineModelofHereditaryTyrosinemiaType-I.NatureGenetics,1995.10(4):p.453-460.Huang,P.,etal.,Inductionoffunctionalhepatocyte-likecellsfrommousefibroblastsbydefinedfactors.Nature,2011.475(7356):p.386-9.Mars,W.M.,etal.,Immediateearlydetectionofurokinasereceptorafterpartialhepatectomyanditsimplicationsforinitiationofliverregeneration.Hepatology,1995.21(6):p.1695-701.Jimenez-Sanchez,M.,etal.,TheHedgehogsignallingpathwayregulatesautophagy.NatCommun,2012.3:p.1200.Carpenter,R.L.andH.W.Lo,HedgehogpathwayandGLI1isoformsinhumancancer.DiscovMed,2012.13(69):p.105-13.Eichenmuller,M.,etal.,BlockingthehedgehogpathwayinhibitshepatoblastomaHepatology,2009.49(2):p.482-Duncan,A.W.,C.Dorrell,andM.Grompe,StemCellsandLiver14Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2009.137(2):p.466-Mishra,L.,etal.,Liverstemcellsandhepatocellularcarcinoma.Hepatology,2009.49(1):p.Yang,L.,etal.,Sonichedgehogisanautocrineviabilityfactorformyofibroblastichepaticstellatecells.JHepatol,2008.48(1):p.98-106.Jung,Y.,etal.,Accumulationofhedgehog-responsiveprogenitorsparallelsalcoholicliverdiseaseseverityinmiceandhumans.Gastroenterology,2008.134(5):p.1532-43.Michelotti,G.A.,etal.,Smoothenedisamasterregulatorofadultliverrepair.JClinInvest,2013.123(6):p.2380-94.Tsukamoto,H.,etal.,Morphogensandhepaticstellatecellfateregulationinchronicliverdisease.JGastroenterolHepatol,2012.27Suppl2:p.94-8.myofibroblastictransformationofrathepaticcellsincultureandcirrhosis.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2009.297(6):p.G1093-106.Nejak-Bowen,K.N.,etal.,Gliotoxin-inducedchangesinratliverregenerationafterpartialhepatectomy.LiverInt,2013.33(7):p.1044-55.Suarez-Cuenca,J.A.,etal.,Partialhepatectomy-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配體的誘導釋放和某些通路成員基因的表是如何被誘導激活的③確定肝再生中，Hh以及Hh通路下游的靶細胞的類型，將來潛在在肝損傷修復的作用獲得理論依據(jù)和潛在Hh④確定通路激活產(chǎn)生的作用是否為肝再生過程中無可替⑤檢驗通路的特異激活能促進肝究論文1篇，5分以上的研究論文2擬解決的關鍵科學問（1）肝再生是否有普遍激活，針對特殊的肝導的肝再生有無存在顯著的特異（2）是什么原因引起配體的釋放，是由什么細胞（3）再生中Hh配體作用的靶細胞，其具體方式如何（4）Hh激活是否為肝再生必要（5）對激活的專一調(diào)控能否促進肝再生中的肝實質(zhì)細胞版本19實質(zhì)細胞3．擬采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術路驗手段、關鍵技術等說明 研究實質(zhì)細胞3．擬采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技術路驗手段、關鍵技術等說明 研究Hh信號激活的表現(xiàn)形式。首先，在先前結果的基礎上，我們將全面分析Hh信號激Fah-/-小鼠中移植肝實質(zhì)細胞的再植過程中的表現(xiàn)形式。對移植肝質(zhì)細胞的再植過程中的Hh信號激活表現(xiàn)形式的全面分析，有助于獲具體Hh信號通路成員活動特點，和它們在整個過程中的具體變化，下一步的研究提供線索實現(xiàn)最終能夠調(diào)控Hh信號激活的位點和程度在肝實質(zhì)細胞移植入Fah-/-小鼠的肝臟后，每隔1周取再植小鼠肝臟組織，共8周，采用qRT-PCR和blot/免疫組化分別從水平和蛋白水平比較Hh信號通路在不同的時相的表達和激活情況將用到的PCR引物如下primerSequence(5'-TmProductsize2018s通過免疫熒光染色分析上述基因在肝再生進程中不同時間把上述基18s通過免疫熒光染色分析上述基因在肝再生進程中不同時間把上述基因表達定位于肝實質(zhì)細胞和/或非實質(zhì)細胞而表達的非實細胞又具體定位于肝星狀細胞、竇內(nèi)皮細在上述實驗的基礎上通過所獲取的最新信息進一步篩選未知Hh信號通路其他成員和與Hh信號通路相聯(lián)系的其他信號途徑的可能與。提取上述各階段肝臟組織的RNA，通分析基因譜。在基因表達的時項分析中，以傳統(tǒng)肝切模型中各相關階段的基表達譜作為研究的對照處理。根據(jù)基因表達譜篩選肝再生關鍵階段信號通路其他成員如類運動蛋白(Cos2酸/蘇氨酸蛋白激酶(FuFu抑制劑(SuFu)、蛋白激酶A(PKA)的可 Hh抑制劑對Fah-/-小鼠肝再植效率的影實驗中應用Hh抑制劑的目的在于證明已發(fā)現(xiàn)Hh信號通路的激Fah-/-小鼠肝再植效率的影響，以及影響的程度。由于Fah再植的程度在研究中能夠定量分析，因此，此項指標能體現(xiàn)Hh路激活對促進肝實質(zhì)細胞增殖的程度。同時，預期結果也將能夠說是否Hh信號通路激活的作用一旦被阻斷，是否能被其他未知的促進生機理所在研究實驗的實施中在再植的第2周開始應用Hh配體的抑制劑(GDC-版本21至第8Hh信號通路中各成員在mRNA水平和蛋白水平的抑制情至第8Hh信號通路中各成員在mRNA水平和蛋白水平的抑制情定量分析這個過程中移植細胞再植簇群是增長是否受到抑與Hh信號通路中成員受抑制的時序關系c.用相同的方法分析應用Smoothened(Smo)的口服拮CyclopamineGli1及Gli2誘導轉錄的抑制劑GANT61的情況下Hh信號路中各成員和移植細胞再植簇群的改變 提高Hh信號通路中關鍵因子的表達對肝再植的影此部分的研究將成為探討將來實現(xiàn)調(diào)控Hh信號通路的活性所嘗試。我們認真分析和不同Hh信號通路的成員后，選定了一下過基因轉入的方式，實現(xiàn)這些成員基因的高表達。通過此部分的研實驗，將實現(xiàn)對基因轉入方法提高Hh信號通路活性的可行性的認識對具體的Hh信號通路成員基因轉入實現(xiàn)初步的認識。此結果探討將來利用Hh信號通路成員基因轉入實現(xiàn)初步在臨床應用的可a.采用SleepingBeaty轉座系統(tǒng)，將Smo基因的shRNA導入Fah鼠肝利用定量PCR和免疫熒光染色研究Hh信號通路中各成員的達是否增強，再分析比較其是否能促進移植細胞再植簇群的給導入Smo基因的shRNA的Fah-/-小鼠從第2周開始給予NTBC以停肝損傷，通過定量PCR、免疫熒光染色、免疫組化染色分析Hh信號的激活對健康肝的肝再植的2）關鍵本項目所涉及的研究方法主版本22（1）Fah-/-小鼠的肝實質(zhì)細胞移Fah-/-小鼠的肝實質(zhì)細胞術是申請人長期使用的實驗技術。主（1）Fah-/-小鼠的肝實質(zhì)細胞移Fah-/-小鼠的肝實質(zhì)細胞術是申請人長期使用的實驗技術。主要操作是將分離好的肝實質(zhì)細分散在PBS液中，通過脾臟注射將肝實質(zhì)細同時撤除水喂外源肝實質(zhì)細胞將在Fah-/-小鼠肝臟中再生重建整個（2）SleepingBeauty轉座子系統(tǒng)。SleepingBeauty轉座子系轉座酶可將兩個轉座子間的序列轉移到哺乳動物細胞基因組當中。們設計的Beauty轉座子系統(tǒng)的兩個轉座子間，包括Fah基和shRNA的表達序列（圖1。當將該Beauty轉座子質(zhì)粒通尾靜脈快速注射到Fah-/-小鼠體內(nèi)后，部分質(zhì)粒可進入肝實質(zhì)細胞表達轉座酶，并將轉座子間的序列插到基因組當中。當給Fah撤除NTBC水后，插入該序列的肝實質(zhì)細胞可表達Fah基因而存表達Fah的肝實質(zhì)細胞將會死亡。表達Fah基因的肝實質(zhì)細胞從而大增殖重建小鼠3）可行性分在本項目中，影響其可行性的主要因（1）Fah-/-小鼠肝再生實驗室已大量繁育出該小鼠用實驗。申請人過去多年的研究中一直使用該小鼠模型，十分熟悉相的如肝實質(zhì)細胞移植、尾靜脈注射等版本23（2）SleepingBeauty統(tǒng)。該轉座系統(tǒng)早已應Fah-/-小的肝再生研究當中，且已發(fā)表多篇論文。（2）SleepingBeauty統(tǒng)。該轉座系統(tǒng)早已應Fah-/-小的肝再生研究當中，且已發(fā)表多篇論文。申請人實驗室已獲得該轉系統(tǒng)，并已開始應用除上述實驗系統(tǒng)外，其余的實驗均為常規(guī)的生化、分子、遺驗。申請人實驗室均已建立相關的實驗平臺。申請人認為本項目已備了順利開展和圓滿完成的4．首次系統(tǒng)性驗信號通路激活在亞急性肝損傷肝過程中的5．年度研究計劃及預期研究結果（包括擬組織的重活動、國際合作與交流計劃等1）年度2016.1-確定Fah-/-小鼠中移植肝實質(zhì)細胞的再植肝再生過程中的分析信號激活的表現(xiàn)2017.1-抑制和激活Hh號通路對肝再生中肝內(nèi)非實質(zhì)胞和實質(zhì)細胞的影響2018.1-2018.12:確定信號通路調(diào)控肝實質(zhì)細胞增殖2019.1-2019.12:在其他肝損傷模型中驗證上述機制理數(shù)文章并投稿2）預期（1確定Fah-/-小鼠肝再生過程中Hh信號激活的表現(xiàn)形式和時空（2）確定Hh信號激活對促進肝實質(zhì)細胞增（二）版本241．工作基礎（與本項目相關的研究工作積累和已取得的研究成績我1．工作基礎（與本項目相關的研究工作積累和已取得的研究成績我們通過分析肝實質(zhì)細胞移植Fah擴增過程，確認該肝再生模型中，外源肝實質(zhì)細胞的大規(guī)模擴增主發(fā)生在細胞移植后2-5周（圖S1AKi67染色說明該有外源肝實質(zhì)細胞（Fah性細胞）發(fā)生增殖（圖S1B。由于實質(zhì)細胞易于實驗操作，F(xiàn)ah-/-小鼠肝損傷模型十分適于研究肝實細胞在肝再生過程中的圖 Fah-/-小鼠肝再生過程2）我們的前期研究工Fah-/-小鼠移植細第1周至第8周的存活情況以看到在第5開始出現(xiàn)明顯的增殖并且在第6周達到平臺期，在第8周的時候趨于穩(wěn)定（圖S2版本25Fah-/-小鼠移植細胞后再植簇群的Fah-/-小鼠移植細胞后再植簇群的增殖情3）我們microarray了肝實質(zhì)細胞Fah2周70%肝切12小時（即肝切模型中肝實質(zhì)細胞起始增殖的時間）肝臟基因表達譜。我們發(fā)現(xiàn)，與肝切模型相比，肝Fah肝實質(zhì)細胞起始增殖時，Hh信號通路中的Ptch著上調(diào)12（S3A而作為抑制因子的Hhip顯著下調(diào)5倍（S3B未顯示沒有明顯變化的版本26圖S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生圖S3Fah-/-小鼠和肝切除模型肝再生過程的基因表達4我們已發(fā)現(xiàn)Fah-/-小鼠移植細胞的再植（repopulating與炎癥細胞簇在取自再植過程的肝組織免疫組化切片染色分析中信號通路作用下的細胞與細胞相互作用（圖S4圖S4細胞-細胞相互作用，Hh配體的釋放可能包括來自與再殖區(qū)相接觸的炎細胞5小鼠的基因治療（S5A。將含有Fah光素cDNASBFah-/-小鼠的肝細胞，獲得了Fah基因（S5，B）和熒光素基（S5，C）的穩(wěn)定表達。通過非侵入性活體體內(nèi)光學成像技術，版本27時定量觀察了表達蛋白的肝細胞在Fah-/-小鼠肝臟中的再殖情因此，我們時定量觀察了表達蛋白的肝細胞在Fah-/-小鼠肝臟中的再殖情因此，我們已經(jīng)具備了系統(tǒng)傳遞外源基和利用非侵入性體外熒光成像技術評價肝臟再殖的圖S5課題合作者實驗室曾進行Fah-/-小鼠肝臟中非病毒性轉基因載體的檢測6）課題合作者實驗室比較了誘導酪氨酸血癥和不誘導酪氨酸血癥但分肝切Fah-/-小鼠間肝細胞移植后的肝臟再殖情況。移植型肝細胞，停藥后Fah-/-小鼠的肝臟再殖可達到95%以上（圖6，細胞移植后的時間效應。在肝臟再殖過程因為血癥，其內(nèi)在的肝細胞逐漸死亡，供體肝細胞明顯增3000倍。另一方面，給與NTBC藥物的Fah-/-小鼠是健康的大部肝切除，小鼠肝臟再殖效率卻不超過1%氨酸血癥，內(nèi)源性肝細胞與供體肝細胞相比更具生長版本28圖 誘導酪氨酸血癥和不誘導酪氨酸血癥但部分肝圖 誘導酪氨酸血癥和不誘導酪氨酸血癥但部分肝切Fah-/-小鼠間肝細胞移后肝臟再植的比2．工作條件（包括已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條； 也是動物學國家重點學科、國家“實版本2942503．承擔科研項目情況（申請人和項目組主要參與者正在承擔項目包括國家42503．承擔科研項目情況（申請人和項目組主要參與者正在承擔項目包括國家自然科學基金的項項目的名稱和編號經(jīng)費來源、起止年月、與本項目的關系及負責的內(nèi)容等王欣正在承擔的基金1、轉錄因子GATA4和Foxa2在調(diào)控內(nèi)胚層細胞肝向分化中的相互作用。（31271469，902利用新型基因敲除和細胞轉移技術建立人源化肝臟豬的模型（31271042，804．完成國家自然科學基金項目情況（對申請人負責的前一個科學基金項目（項目名稱及批準號）完成情況、后續(xù)研究進展及與申請項目的關系加以詳細說明。另附該已結題項目研究工作總結摘（限字）和相關成果的詳細目錄無（三）購置單項經(jīng)費萬元以上固定資產(chǎn)及設備等，須逐項說明與項的直接相關性及必（四）無版本30教育經(jīng)歷（按時間倒排序---教育經(jīng)歷（按時間倒排序---工作經(jīng)歷（科研與學術工作經(jīng)歷，按時間倒序排序授；1992/7—1995/9：B2012101；2012.9-2014.9版本31版本32王簡歷王欣，男，1963年7月18日生，理學博士，教授，博士生導師現(xiàn)在任東莞明珠實驗動物有限公司客座教授，內(nèi)王簡歷王欣，男，1963年7月18日生，理學博士，教授，博士生導師現(xiàn)在任東莞明珠實驗動物有限公司客座教授，內(nèi)蒙古大學教授，美國兩公司的創(chuàng)辦人。主要從事肝細胞生物學、肝臟和胰腺干細胞以及全能性干的肝向分化、人源化肝臟嵌合體動物等研究，近年來取得了一系列突出的成績。項目的共同設計教育經(jīng)歷（從大學本科開始，按時間倒排序年——2003年，美國Oregon大學，醫(yī)學院年——1998年，美國紐約州立大學，攻讀博士年——1990北京醫(yī)科大學，生物與遺傳系，攻讀年——1985年，山東大學，生物系，攻讀本科學工作經(jīng)歷（科研與學術工作經(jīng)歷，按時間倒排序2011年至今，東莞松山湖明珠實驗動物公司，客座教2006年——2011年中國科學院上海生化細胞所，中國科學院干細胞生學重點實驗室主年——2008年，明尼蘇達大學，實驗醫(yī)學和病理學系，干細胞研所任助理教年——1998年，美國紐約州立大學，藥物與藥理學院，生物化學的理學系，研究生研究1990年——1992年，北京醫(yī)科大學，生物與遺傳系1987年——1990年，北京醫(yī)科大學，生物與遺傳系版本331、發(fā)現(xiàn)了造血干細胞能轉化為有代謝功能的肝臟實質(zhì)細胞（AmericanJournalof（Nature20031、發(fā)現(xiàn)了造血干細胞能轉化為有代謝功能的肝臟實質(zhì)細胞（American