基因工程課件

D基因工程的支撐技術

基因工程的基本原理C基因工程的基本原理B基因的分子生物學A重組DNA技術的理論基礎A重組DNA技術的理論基礎2基因工程的基本原理19世紀中孟德爾

豌豆雜交試驗

遺傳因數

經典遺傳學20世紀初摩爾根

果蠅雜交實驗

基因

基因學1944年艾弗瑞

肺炎雙球菌轉化實驗

遺傳物質DNA1973年伯格-傑克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結構

分子生物學基因工程B基因的分子生物學2基因工程的基本原理C基因工程的基本原理2基因工程的基本原理提高外源基因的劑量——分子遺傳學原理篩選修飾重組基因表達的轉錄調控元件，如：啟動子、

增強子、操作子、終止子、上游調控序列等列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學原理

修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩(wěn)定生產——生化工程學原理

——分子生物學原理

D基因工程的支撐技術2基因工程的基本原理核酸凝膠電泳技術核酸分子雜交技術細菌轉化轉染技術DNA序列分析技術寡核苷酸合成技術基因定點突變技術聚合酶鏈反應（PCR）技術

基因工程的基本條件C用於基因轉移的受體菌或細胞B用於基因克隆的載體A用於核酸操作的工具酶A用於核酸操作的工具酶3基因工程的基本條件限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的發(fā)現及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，並切割DNA雙鏈主要存在於原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵細菌的限制與修飾作用hsdR：編碼限制性核酸內切酶hsdM：編碼限制性甲基化酶hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出

HindII和HindIII

限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的類型主要特性I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結構異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因數ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+識別序列TGAN8TGCT旋轉對稱序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內或附近距識別序列下游隨機性切割特異性切割24-26bp處限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點EcoRI等產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPstI等產生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作大部分II型核酸內切酶需要相似的反應條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸內切酶的酶活性：在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’限制性核酸內切酶II型限制性核酸內切酶酶解反應的操作II型核酸內切酶的多酶聯(lián)合酶解：對鹽濃度要求不同的酶，可採取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解低鹽酶先切，然後補加鹽，高鹽酶再切一種酶先切，然後更換緩衝液，另一種酶再切0.1倍體積的5MNaAcpH5.42.5倍體積的冰冷乙醇冰浴5分鐘、高速冷凍離心10分鐘、乾燥限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的純度：蛋白質、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應總體積延長反應時間限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素DNA樣品的甲基化程度：大腸桿菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響

大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基限制性核酸內切酶影響限制性核酸內切酶活性的因素核酸內切酶的緩衝液性質：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的Staractivity現象

EcoRI在正常條件下識別並切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過5%（v/v）時，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶的反應條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15℃反應1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬於分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬於分子間的連接，因此後者反應速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大於粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mMDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶I的基本性質：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口前移標記法大腸桿菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation製備32P標記的探針DNaseIDNApolIDNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙去氧末端終止法測定DNA序列DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內切酶產生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘DNA聚合酶依賴於RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：以RNA為範本聚合cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反轉錄酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNA聚合酶依賴於RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）反轉錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈反轉錄酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反轉錄酶5’

DNA3’核酸酶單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’核酸酶雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoVII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切核酸酶雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特異性地從5‘端外切3’5’3’5’核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻穀麯黴菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最適pH範圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切單鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+核酸酶單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA環(huán)化AC核酸修飾酶末端去氧核苷醯轉移酶（TdT）TdT的基本特性：來自小牛胸腺不需要範本的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAA核酸修飾酶鹼性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的鹼性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的鹼性磷酸單酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON核酸修飾酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用於探針的末端同位素標記：B用於基因克隆的載體3基因工程的基本條件質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特徵載體的功能及特徵載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供複製能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體的功能及特徵載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的複製位點或整合位點質粒質粒的基本特徵質粒是生物細胞內固有的、能獨立於寄主染色體而自主複製、並被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質粒常見於原核細菌和真菌中絕大多數的質粒是DNA型的絕大多數的天然DNA質粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結構，即cccDNA質粒DNA的分子量範圍：1-300kb質粒質粒的基本特徵質粒的自主複製性質粒能利用寄主細胞的DNA複製系統(tǒng)進行自主複製質粒DNA上的複製子結構決定了質粒與寄主的對應關係根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質?？煞譃閮纱笱}製類型：嚴緊型複製控制的質粒1-3拷貝stringentplasmid鬆弛型複製控制的質粒10-60拷貝stringentplasmid質粒質粒的基本特徵質粒的自主複製性：拷貝數的控制機制–質粒DNA複製啟動控制控制複製引物與範本的結合oriE.coliColE1

plasmid複製方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’質粒質粒的基本特徵質粒的自主複製性：拷貝數的控制機制–質粒DNA複製啟動控制控制複製起始因數與複製起始位點（ori）的結合PcopcopP/OrepreporiCopRep質粒質粒的基本特徵質粒的不相容性任何兩種含有相似複製子結構的不同質粒，不能同時存在於一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的複製子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的複製子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的複製子結構，彼此不相容粒組成不相容性群質粒質粒的基本特徵質粒的不相容性：分子機制兩種含有相似複製子結構的不同質粒，在複製時受到同一種拷貝數控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，兩種含有不同複製子結構的不同質粒，在複製時各受自己的拷貝數控制系統(tǒng)的調節(jié)，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定，因此在經過若干複製週期和細胞分裂週期後仍能共處於同一細胞內其中拷貝數多的質粒在以後的細胞分裂週期中更具優(yōu)勢質粒質粒的基本特徵質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等如Col、R的其他成員非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定質粒質粒的基本特徵攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義質粒質粒的構建天然存在的野生型質粒由於分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數幾個野生型質粒構建的：pSC101

8.8kb拷貝數5四環(huán)素抗性標記基因TcrColE16.5kb拷貝數20-30大腸桿菌內毒素標記基因E1RSF2124ColE1衍生質粒氨芐青黴素抗性標記基因Apr質粒質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類：高拷貝質粒突變拷貝數控制基因拷貝數1000-3000擴增基因低拷貝質粒來自pSC101拷貝數小於10

表達某些毒性基因溫敏質粒在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合質粒裝有整合促進基因及位點便於外源基因的整合穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的複製子便於基因克隆表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒裝有報告基因便於啟動子等元件的克隆篩選質粒重要的大腸桿菌質粒載體鬆弛型複製pBR322：氯黴素可擴增拷貝數50-100/cell用於基因克隆質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：拷貝數2000-3000/cell用於基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’質粒重要的大腸桿菌質粒載體pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質粒重要的大腸桿菌質粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’用於外源基因的高效表達注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等質粒質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法製備質粒DNA：氯化銫密度梯度離心法

質粒DNA純度高、週期長、設備要求高、溴乙錠污染堿溶法

質粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法

質粒DNA純度、操作週期介於氯化銫法和堿溶法之間質粒質粒DNA的分離純化氯化銫密度梯度離心法：

用含有EDTA的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉澱cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質粒質粒DNA的分離純化堿溶法：

用含有EDTA的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內含物

加高濃度的醋酸鉀溶液，沉澱染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質乙醇或異丙醇沉澱水相質粒DNA用無DNase的RNase去除殘餘的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質粒質粒DNA的分離純化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的緩衝液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁沸水浴40秒鐘離心，用無菌牙籤挑去沉澱物乙醇或異丙醇沉澱質粒DNA噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細胞，然後或自主複製繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主複製繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體的生物學特性：

生物結構l噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成

l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61個基因l噬菌體生物學特性：

生物結構5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染週期E.coli吸附LamB受體注入複製包裝裂解噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

感染週期體內包裝100個左右的拷貝包裝範圍為原DNA的75-105%即36-51kbDA噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl噬菌體生物學特性：

溶原狀態(tài)l噬菌體感染大腸桿菌後，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，並不產生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產物所啟動，而這兩個基因的開放與關閉又取決於宿主細胞本身的性質。人們可以根據需要改變l-DNA或宿主細胞的性質，使噬菌體或處於溶菌狀態(tài)，或處於溶菌狀態(tài)DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶菌狀態(tài)噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大於2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是複製和裂解所非必需的。根據切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體：插入型載體取代型載體噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：刪除重複的酶切位點野生型的l-DNA鏈上有5個EcoRI位點和7個HindIII位點，不利於重組操作，必須刪除至1-2個同時，為了便於各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要採用定點突變技術去除或增添酶位點噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：加裝選擇標記與質粒不同，野生型l-DNA上缺少合適的選擇標記，因此加裝選擇標記是l-DNA克隆載體構建的重要內容l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：免疫功能類標記顏色反應類標記噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：加裝選擇標記imm434imm434基因編碼一種阻止l-噬菌體進入溶菌迴圈的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞後，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌迴圈，形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：加裝選擇標記lacZlacZ基因編碼b-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體l-DNA則產生藍色透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的構建：構建琥珀密碼子的突變體

琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型l-DNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株後，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體Charon2、Charon6、lgt11取代型載體lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正選擇型載體lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌體不能在P2噬菌體溶源性的細菌中繁殖（Spi+），這種生長抑制表型受l-DNA上的red和gam兩個基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，並形成透明斑噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA重組分子的體外包裝：l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞用於體外包裝的蛋白質可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合後，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染後，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基於安全而設計的噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期

加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時。這時噬菌體顆粒

密度已達1013-1014/L，大腸桿菌細胞已完全裂解

超速離心，沉澱噬菌體苯酚抽提，釋放l-DNA

乙醇或異丙醇沉澱l-DNA

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的l噬菌體DNAl-DNA作為載體的優(yōu)點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大於質粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達

外源基因噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：

生物結構M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13

噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長

噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：

感染週期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的構建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的M13單鏈噬菌體DNAM13DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易於辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb噬菌體或病毒DNA與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病

毒基因組DNA。動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結構，可將動植物病毒分成四大類：單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我複製時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規(guī)的DNA重組。考斯質粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯質粒和噬菌粒載體的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序列與質粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路。當然，由於考斯質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。考斯質粒與噬菌?？妓官|粒（cosmid）考斯質粒載體的構建：考斯質粒是一類人工構建的含有1978年Collins和Hohn發(fā)明構建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和質粒複製子的特殊類型的載體cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載範圍為31-45kb考斯質粒與噬菌粒考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，並高效轉染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小範圍能像質粒那樣在受體細胞中自主複製重組操作簡便，篩選容易不能體內包裝，不裂解受體細胞考斯質粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、複製子以及質粒複製子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，並高效轉染受體細胞

裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10kb）能像質粒那樣在受體細胞中自主複製重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA考斯質粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119pUC19+M13間隔區(qū)IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA考斯質粒與噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子PT3和PT7強化外源基因的轉錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實現外源基因的體外轉錄人造染色體載體

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千kb的DNA片段，此時考斯質粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因數或酵母菌染色體上的複製區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上後，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的複製並遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體細菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因數F質粒的基礎上構建的，其裝載量範圍在50-300

kb之間各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用於：克隆大型基因簇（genecluster）結構構建動植物基因文庫人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC載體應含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的複製子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標記大腸桿菌的複製子

大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為350-400kb人造染色體載體酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉化酵母菌重組酵母染色體C用於基因轉移的受體菌或細胞3基因工程的基本條件各種基因工程受體的特性實驗室常用的基因工程受體受體細胞應具備的條件受體細胞應具備的條件限制性缺陷型外切酶和內切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型用於基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-）具有較高的轉化效率具有與載體選擇標記互補的表型感染寄生缺陷型防止重組細菌擴散污染，生化武器除外

各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定適用於外源DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構建，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌產結構複雜、種類繁多的內毒素各種基因工程受體的特性枯草桿菌遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產內毒素適用於原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備各種基因工程受體的特性鏈黴菌抗生素的主要生產者，分子遺傳相對操作簡便，不產內毒素主要用於抗生素生產菌株的改良遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢各種基因工程受體的特性酵母菌具有真核生物的特徵，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定適用於外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構建、真核生物基因表達調控的研究，是DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌內源性蛋白產物種類繁多且含量高各種基因工程受體的特性昆蟲細胞（家蠶）具有真核生物的特徵，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定適用於真核生物基因的高效表達

DNA重組操作系統(tǒng)欠完善各種基因工程受體的特性哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO）

與人的親緣關係近，分子重組表達系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)適用於哺乳類動物和人的基因表達調控研究、基因藥物的生產，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體細胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢各種基因工程受體的特性植物細胞（擬南芥菜、煙葉）

農作物的經濟意義重大，轉基因植物細胞易於分化，細胞培養(yǎng)簡單且成本低廉，具有光合作用適用於高等植物基因表達調控的研究、基因藥物的生產，農作物品質的改良遺傳操作繁瑣實驗室常用的基因工程受體大腸桿菌用於接受質粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）

用於接受l-DNA：LE392、ED8654

酵母菌哺乳動物細胞CHO畢赤酵母啤酒酵母

基因工程的操作過程C轉化子的篩選和鑒定（檢）B重組DNA分子的轉化和擴增（轉、增）ADNA的體外重組（切、接）4基因工程的操作過程切接轉增檢ADNA的體外重組（切與接）4基因工程的操作過程同種內切酶生產的粘性末端的連接同尾酶生產的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率同種內切酶生產的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同尾酶生產的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow補平Klenow補平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的連接平頭末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更換BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow補平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數/載體分子總數在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25-75%重組率是衡量連接反應效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的後續(xù)操作。重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO鹼性磷酸單酯酶鹼性磷酸單酯酶重組率提高重組率的方法加裝同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重組DNA分子的轉化和擴增（轉與增）4基因工程的操作過程轉化的原理與技術轉化率轉化細胞的擴增轉化的原理與技術Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用於革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，後者經熱脈衝發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)

轉化的原理與技術Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的製備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體

用10ml冰冷的10mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時，備用收集菌體轉化的原理與技術Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的質粒轉化：取100ml感受態(tài)細胞，加入相當於50ng載體的重組冰浴放置半小時在42℃保溫2分鐘（熱脈衝）快速將轉化細胞轉移至冰浴中放置1-2分鐘DNA連接液，混勻加入1ml新鮮培養(yǎng)基，於37℃培養(yǎng)1小時（擴增）塗在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選

轉化的原理與技術細菌原生質體的轉化革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈黴菌等）接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常採用原生質體（細胞去壁後的形態(tài)）轉化的方法轉移質?；蛑亟MDNA分子

酵母菌、黴菌、植物細胞也可用原生質體法進行轉化

轉化的原理與技術細菌原生質體的轉化不同細菌的原生質體制備方法不盡相同，以鏈黴菌為例：細菌需生長