生物化學 第二十章常用分子生物學技術的原理及應用

第二十章常用分子生物學技術的原理及應用第一節(jié)分子雜交與印跡技術MolecularHybridizationandBlottingTechnique分子雜交技術分子生物學中用于檢測生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術。樣品制備電泳雜交轉膜結果顯示探針制備分子雜交原理及流程圖

分子雜交種類

按分子種類分為

1）DNA雜交—探針為DNA或RNA

2）RNA雜交—探針為DNA或cDNA3）蛋白質免疫分析—探針為抗體

分子雜交以DNA的變性和復性為理論基礎。DNA變性：DNA在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程。DNA的復性：變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程。

核酸分子雜交：不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。

一、核酸分子雜交技術（molecularhybridization）

復性RNADNA印跡技術利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術。

用放射性核素、生物素、地高辛或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

探針技術核酸探針（probe）

1、定義：

是一段與被檢測核酸序列互補的帶有標記的核苷酸片段，長度一般為十幾到幾千個堿基不等。

2、探針標記方法：（1）放射性同位素標記（2）生物素標記（3）地高辛標志物（4）分子信標探針可以與目的核酸結合，對核酸進行定性和定量分析。二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質定性定量及相互作用研究。其他：斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(DNAchip)三種印跡技術的比較分子雜交實驗①②③放射自顯影照片DNA芯片技術第二節(jié)PCR技術的原理與應用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology美國科學家Kary.Mullis

PCR儀出現(xiàn)之前，PCR是一項十分繁瑣的技術，同時需要許多人在一堆試管、秒表和不同溫度的水浴鍋中忙個不停，甚至還要獨立的作業(yè)空間防止可能的污染，需要長時間的反復操作，手腳不利落的人是做不來的。Saiki的結果則干凈漂亮，讓人心服口服。

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Primer15

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TemplateDNA一、PCR技術的工作原理5

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。PCR技術原理示意圖PCR的基本反應步驟變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C預變性94?C最后延伸72?C

錢嘉韻黃石公園的熱泉里發(fā)現(xiàn)的嗜熱菌，成功分離出該細菌耐高溫的TaqDNA聚合酶。

Mullis雖然提出將TaqDNA聚合酶應用到PCR的建議。1986年6月，Saiki首度將其應用于PCR，效果就好得驚人，可以說是一炮打響。自此，PCR大獲成功。耐熱的DNA聚合酶模板DNA特異性引物（上游引物、下游引物）耐熱DNA聚合酶BufferdNTPsMg2+H2O

PCR體系基本組成成分salts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAPCR儀PCR的基本反應步驟變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C預變性94?C最后延伸72?C利用特異性引物以cDNA、基因組DNA為模板獲得目的基因片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。二、PCR技術的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技術可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。

PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突變將PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析逆轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉錄反應和PCR反應聯(lián)合應用的一種技術。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉錄PCR技術三、幾種重要的PCR衍生技術原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術和原位雜交技術的不足，是將目的基因的擴增與定位相結合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術（三）實時PCR技術實時PCR(real-timePCR)技術通過動態(tài)監(jiān)測反應過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR(qPCR)。實時PCR分類：實時PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法

2.分子信標探針法

3.FRET探針法熒光定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。與常規(guī)PCR技術比較：對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。熒光定量PCR原理－－定義非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記

TaqManProbe常用熒光標記方法SYBRGreenI染料法——原理

SYBRGreenI是能結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI

SYBRGreenI只有和雙鏈DNA結合之后才發(fā)熒光熒光定量PCR

使用方便，不必設計復雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點

對引物特異性要求較高不能進行多重定量靈敏度相對較低無模板特異性，不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級結構，非特異性產(chǎn)物需要做熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性缺點SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點熔解曲線分析單一峰，無非特異性產(chǎn)物，定量準確有雜峰，有非特異性產(chǎn)物，定量不準確unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點：特異性高：只有引物和探針都和同一模板結合時才能檢測完全實時監(jiān)測：一分子熒光信號對應一條DNA鏈的產(chǎn)生多通道檢測：可以在一次反應中同時檢測多個不同目的基因序列Taqman探針法Taqman探針：是與目的序列互補的寡聚核苷酸，5‘端標記熒光報告集團，3’端標記熒光淬滅集團，探針完整時不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。第三節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。

用于構建基因組文庫的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。

二、cDNA文庫基因組文庫和cDNA文庫的構建和篩選第四節(jié)生物芯片技術BiologicalChipTechnique是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結果。該技術亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。二、蛋白質芯片蛋白質分子間的親和反應蛋白質芯片(proteinchip)蛋白質芯片作用原理第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質相互作用研究技術酵母雙雜交各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉換效應分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質相互作用的研究技術標簽融合蛋白結合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合的具體結構部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結合的未知分子。標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖（二）酵母雙雜交技術的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應用證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質分子的的相互作用功能結構域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質。電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉錄因子研究的經(jīng)典方法