細(xì)胞基因組DNA的提取

細(xì)胞基因組DNA的提取銀巍中山醫(yī)學(xué)院生化教研室精選課件實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類DNA主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA〔mtDNA〕，葉綠體DNA〔cpDNA〕，質(zhì)粒DNA。RNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。精選課件別離純化核酸總的原那么：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)到達(dá)的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原那么一、實(shí)驗(yàn)原理精選課件核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。③減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。

3、核酸制備的一般原那么一、實(shí)驗(yàn)原理精選課件核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸別離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中精選課件核酸酶的抑制和抑制劑降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷那么更重要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。4、核酸制備的一般方法和原理一、實(shí)驗(yàn)原理精選課件核酸酶的抑制和抑制劑DNase抑制①參加少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase根本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。精選課件核酸酶的抑制和抑制劑RNase抑制①操作要帶手套。②所有器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在別離過程中要參加一定的RNase抑制劑。精選課件核酸制備中常用的去垢劑核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉精選課件核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中別離除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC精選課件核酸制備中常用的酶

DNase

RNase

蛋白酶K

溶菌酶

精選課件核酸提取的一般過程1〕破碎細(xì)胞〔防止核酸酶的作用〕微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。細(xì)胞器DNA：首先純化細(xì)胞器。

以上處理時(shí)均要同時(shí)參加核酸酶抑制劑精選課件核酸提取的一般過程2〕破碎抽提核酸除去雜質(zhì)1．首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分別離2．使核酸與蛋白質(zhì)別離3．除去脂類4．多糖的除去精選課件核酸提取的一般過程3〕核酸的純化根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機(jī)溶劑等〕雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。

精選課件4〕核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)溫度：4℃〔5℃〕最正確和最簡(jiǎn)單-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存保存介質(zhì)：TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0精選課件實(shí)驗(yàn)?zāi)康木x課件材料與試劑精選課件實(shí)驗(yàn)操作與本卷須知,1000rpm,5min離心精選課件精選課件精選課件四、本卷須知——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞〔白細(xì)胞〕組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否那么會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集精選課件四、本卷須知——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩精選課件四、本卷須知——核酸別離、純化采用吸附材料吸附的方式別離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)〔酚/氯仿〕抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心別離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法精選課件四、本卷須知——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)參加1/10體積的NaAc〔pH5.2，3M〕，有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)〔不要過分枯燥〕假設(shè)長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解精選課件DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反響DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)〔2-3次〕五、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反響。

原因?qū)Σ呔x課件材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料防止反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前參加裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，防止反復(fù)凍融問題二：DNA降解對(duì)策

原因五、DNA提取常見問題精選課件實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA喪失盡量選用新鮮〔幼嫩〕的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用