同步熒光光譜法

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同步熒光光譜法(SynchronousFluorescence)精選課件一、同步熒光分析原理同步熒光技術(shù)是同時掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長的情況下來測繪熒光光譜圖。由測得的熒光強(qiáng)度信號對發(fā)射或激發(fā)波長作圖，稱為同步熒光光譜。精選課件SYNCHR.EX.SCANNOR.EM.SCANNOR.EX.SANNOFLUORESCATTERLINE/nmnm精選課件1、固定波長的同步熒光光譜(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL)(1)在同步掃描中，使激發(fā)波長與發(fā)射波長保持固定的波長間距，即常數(shù)。將同步熒光信號對發(fā)射或激發(fā)波長測繪熒光光譜圖，那么為固定波長的同步熒光光譜。精選課件〔2〕定量依據(jù)激發(fā)光譜強(qiáng)度分布發(fā)射光譜強(qiáng)度分布〔2〕同步掃描激發(fā)波長時的發(fā)射光譜〔3〕同步掃描發(fā)射波長時的激發(fā)光譜〔2〕〔3〕〔1〕精選課件〔3〕同步熒光光譜的特點

a.同步光譜與激發(fā)光譜及發(fā)射光譜都有關(guān)系。它同時利用了化合物的吸收特性和發(fā)射特性，因而使光譜分析的選擇性得到改善。b.有利于多組分混合物的分析。同步熒光光譜可以把強(qiáng)帶增強(qiáng)而減小弱帶的干擾。c.可消除Raylei干擾，使Roman強(qiáng)度降低且拉寬。精選課件〔4〕的選擇只有當(dāng)恰好相當(dāng)于某吸收帶和其發(fā)射帶之間波長間距時，才能觀察到同步信號。=斯托克斯位移〔發(fā)射波長與激發(fā)波長之差)與狹縫寬度d的大致原那么：只受瑞利：當(dāng)同時受瑞利和拉曼散射干擾

—測定波—拉曼散射光的波長精選課件

2、固定能量的同步熒光光譜constantenergysynchronousluminescence(CESL)固定能量的同步熒光光譜，是指在同步掃描過程中，使激發(fā)波長與發(fā)射波長之間保持著固定的能量差。RayRoman精選課件常數(shù)表示波數(shù)差與

成正比拉曼光與入射光之間的頻率差稱為拉曼位移精選課件當(dāng)或時固定能量的同步熒光光譜可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波長的同步熒光光譜只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉寬。二者皆能降低光譜的復(fù)雜性，提高選擇性。abcF精選課件二、同步掃描儀器設(shè)備1、固定波長的熒光光譜的獲得

對于以光柵為單色器的熒光分光光度計，只要分別設(shè)置激發(fā)和發(fā)射兩個單色器所需的起始波長，并使它們以同樣的速率進(jìn)行掃描，便可進(jìn)行固定波長同步掃描熒光測定。2、固定能量同步掃描是非線性的可變角同步掃描，需通過微處理機(jī)控制而加以實現(xiàn)。精選課件三、應(yīng)用1、在多環(huán)芳烴分析中的應(yīng)用減小光譜的重疊〔1〕固定波長同步熒光法用于煤中多環(huán)芳烴的測定苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)用標(biāo)準(zhǔn)參加法計算2,3-苯并芴〔2〕低溫固定能量同步熒光法精選課件煤液化樣品中各種有機(jī)物的同步熒光光譜煤液化樣品的固定波長同步熒光光譜精選課件2、同步熒光法在醫(yī)藥檢驗方面的應(yīng)用〔1〕違禁藥品中苯丙胺和嗎啡加奎寧麥角酸二乙酰胺的測定〔2〕二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽精選課件〔3〕酪氨酸和色氨酸嚴(yán)重重疊CWSL的同步熒光色氨酸的光譜特征的同步熒光酪氨酸的光譜特征

or70nm的二階導(dǎo)數(shù)同步熒光可對Trp和Tyr分辨同步熒光可對Trp、Tyr、Phe分辨精選課件〔4〕維生素B1、B2混合物中維生素B1的測定用鐵氰化鉀將B1氧化硫胺熒〔5〕尿液中腎上腺素和去甲腎上腺素的同時測定精選課件總結(jié)：熒光測量穩(wěn)態(tài)測量時間依賴的測量精選課件4-4時間分辨熒光法〔Time–DomainFluorometry〕(Time–ResolvedFluorometry〕精選課件一、時間分辨法原理用短脈沖光源激發(fā)的熒光體群體，隨時間而衰變，其衰變率為受激分子的壽命精選課件用F(t)或N(t)對t作圖1/eF(t)orN(t)tort熒光壽命為熒光強(qiáng)度衰變到初始值的1/e所需要的時間。精選課件特點：采用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源和檢測體系，可以得到在固定波長的熒光強(qiáng)度—時間曲線和在固定時間的熒光發(fā)射光譜?！?〕可以對混合物中光譜重疊但壽命差異的組分進(jìn)行分辨；〔2〕可消除雜質(zhì)與背景熒光；〔3〕可測量溶劑松弛的時間。精選課件二、時間分辨儀器設(shè)備激發(fā)光源、時間延遲設(shè)備、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及設(shè)有門控的檢測器1、激發(fā)光源短脈沖的激發(fā)光源閃光燈氮閃光燈幾條高強(qiáng)度射線氫閃光燈氘閃光燈連續(xù)線強(qiáng)度低精選課件激光器氮分子激光器337.1nm氬離子激光器351nm染料激光器所需波長光子通量大、峰值功率高、單色性好、發(fā)生的光脈沖持續(xù)時間短，激光熒光法具有較高的靈敏度和選擇性。精選課件2、檢測器如光電倍增管帶有門控的精選課件三、時間分辨熒光的分析應(yīng)用熒光體的熒光壽命的測定時間分辨熒光光譜熒光發(fā)射的衰變曲線精選課件1、熒光體混合物中兩組分的同時測定例用8-羥基喹啉-5-磺酸(R)同時測定Al和Ga15.20ml樣品+1ml0.045%R+

2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)調(diào)pH至4.5，稀釋至25ml氘燈激發(fā)測定熒光強(qiáng)度—時間曲線精選課件〔1〕測定熒光衰變曲線

Al–RGa–R可利用上述兩個熒光化合物的差異對它們進(jìn)行同時測定。精選課件〔2〕計算含量鋁配合物和鎵配合物的衰變曲線鋁配合物和鎵配合物的對數(shù)衰變曲線比較〔1〕和〔4〕的熒光強(qiáng)度得Al的含量比較〔2〕和〔5〕的熒光強(qiáng)度得Ga的含量精選課件2、芳基的測定例用ps雙色熒光法對鹵素芳族化合物光離解作用所產(chǎn)生的芳基進(jìn)行檢測〔1〕用25ps，266nm激光脈沖使1-(氯甲基)萘，1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲基)萘等化合物離解產(chǎn)生芳基?！?〕在延遲60ps后，用25ps，355nm激光脈沖激發(fā)芳基的熒光，產(chǎn)生橙色熒光，600nm，10ns，如下圖。精選課件〔a〕和〔c〕一致，是1-萘甲基所致〔b〕和〔d〕一致，是2-萘甲基所致精選課件3、溶劑松弛時間的分辨測量許多分子在基態(tài)時具有從中等到大的偶極矩，在激發(fā)態(tài)時偶極矩發(fā)生變化，從而引起周圍溶劑分子中電子的重排和溶劑分子圍繞激發(fā)態(tài)溶質(zhì)分子偶極的重新定向，這個過程稱為溶劑松弛，這個過程所需的時間叫溶劑松弛時間。在松弛過程中，能量有所降低，因而發(fā)射向長波位移。時間分辨熒光法可記錄不同時間的發(fā)射光譜，因而可測量松弛時間。精選課件例14-氨基苯鄰二酰亞胺〔4-AP〕的丙醇溶液在不同的溫度下的時間分辨的熒光光譜圖室溫下，-132℃熒光光譜與時間t無關(guān)在-77K，熒光光譜與t有關(guān)在4ns，溶劑還未重新取向在23ns，溶劑取向已完成精選課件例22-對-苯甲基萘-6-磺酸鹽染料溶劑甘油溫度A圖4℃1.8ns,8.0ns,12.2nsB圖57℃1.8ns,8.0ns,12.2ns精選課件4-5相分辨熒光法〔Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry)精選課件

Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.精選課件一、相分辨法原理1、單指數(shù)衰變的熒光當(dāng)樣品被激發(fā)光激發(fā)而發(fā)射熒光時，如激發(fā)光的光強(qiáng)度被正弦調(diào)制，其角調(diào)制頻率為，那么發(fā)射光也同樣被調(diào)制。由于吸收和發(fā)射之間的時間延遲，調(diào)制的發(fā)射光比起激發(fā)光在相上延遲了角。但發(fā)射光的調(diào)制比起激發(fā)光的調(diào)制小一些，也即是發(fā)射光的改變局部的相對幅度比起激發(fā)光要小些。精選課件—去調(diào)制因素激發(fā)光和發(fā)射光的光強(qiáng)正弦調(diào)制精選課件在測量相角〔〕或去調(diào)制因素〔m〕之后，可以計算該熒光體的熒光壽命。相分辨法是熒光壽命的測量方法之一。精選課件m10MHz30MHz10MHz30MHz

、m與

的關(guān)系如下：精選課件m隨

的增大而下降m=1發(fā)射光與激發(fā)光的調(diào)制幅度相同m越小發(fā)射光被調(diào)制的幅度越小

隨

的增大而增大，壽命越長，延遲的

越大。當(dāng)熒光分子的壽命越長，發(fā)射相對于激發(fā)延遲的時間就越長。精選課件2、多指數(shù)衰變的熒光如果樣品中含有兩種熒光體，或者單一熒光體而進(jìn)行進(jìn)一步激發(fā)態(tài)反響，那么熒光是雙指數(shù)衰變。如果進(jìn)行多步反響，那么熒光是多指數(shù)衰變。由

和m所計算的

是表觀熒光壽命。如采用相靈敏檢測器的相熒光計，—激發(fā)光的調(diào)制度〔或振幅〕—去調(diào)制因素單一熒光體精選課件對于相靈敏檢測器—穩(wěn)態(tài)熒光光譜—檢測角度在不同相角測定熒光光譜，稱為相靈敏熒光光譜，即為在固定時間的熒光光譜。精選課件假設(shè)樣品溶液中含有A、B兩種熒光體，它們的熒光壽命分別為A和B。如，那么該組分的發(fā)射被抑制精選課件要得到混合物中組分A的穩(wěn)態(tài)光譜，須把檢測器相角調(diào)節(jié)至和組分B正交。這是很費時的，最好得到另外的信息:先得到任何一組分的穩(wěn)態(tài)熒光光譜，然后調(diào)節(jié)檢測器相角至該熒光光譜和混合物的熒光光譜重疊，那么可得到與另一組分正交的相角。使用任何一組分的純?nèi)芤阂源_定檢測器的相角。精選課件當(dāng)用相靈敏檢測器在各種不同檢測器相角測繪樣品的相靈敏熒光光譜。對于單一化合物，其熒光峰波長根本上保持不變而與檢測器相角無關(guān)。如果不是均勻的發(fā)射，那么熒光峰隨著檢測器相角而改變，在不同檢測器相角得到的相靈敏光譜是鑒別不均勻發(fā)射的有力工具。精選課件3、相分辨熒光法與時間分辨熒光法比較用于熒光參數(shù)測量的儀器可分為兩大類穩(wěn)態(tài)測量steady-state時間依賴的測量timedependent相分辨熒光法與時間分辨熒光法本質(zhì)上都是時間依賴或時間分辨的測量。精選課件〔1〕儀器時間分辨熒光法的局限性a.儀器常常非常復(fù)雜，常局限于有關(guān)專家使用；b.靈敏度常低于穩(wěn)態(tài)測量。相分辨法的優(yōu)點a.儀器類似于穩(wěn)態(tài)測量的儀器，使用簡單；b.靈敏度高；c.數(shù)據(jù)處理快。精選課件〔2〕測量參數(shù)a.F(t)-t曲線時間分辨b.m..相分辨精選課件〔3〕從實驗的觀點，相分辨有以下優(yōu)點：在時間分辨的方法中，測量的延遲信號的去卷積對于計算測量系統(tǒng)的限定時間的響應(yīng)是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允許不同方向的直接測量。如在各向異性的延遲測量中，平行和垂直偏振成份的和m的測定；相分辨法為基于熒光壽命差異的光譜成份之直接分辨提供了一種簡單、有效的方法。精選課件二、相分辨儀器設(shè)備

與一般熒光分光光度計大致相似，但增加了光調(diào)制器及測量相角和去調(diào)制因素的設(shè)備。精選課件1、光調(diào)制器〔1〕Kerr調(diào)制器不能透射UV〔2〕Pockels調(diào)制器需要較低電壓，能透過紫外光，可在連續(xù)可變的頻率下操作，但要求高度準(zhǔn)直的光，適用于以激光器為光源的相分辨熒光計?！?〕Dedye-Sears超聲波調(diào)制器能透過紫外光，對光準(zhǔn)直的要求不太高，可用于各種光源。精選課件2、檢測系統(tǒng)

由單色器，光電倍增管，鎖定放大器組成。鎖定放大器只檢測與參比信號相同頻率且具有一定位相關(guān)系的信號成份，從而大大提高了信噪比。精選課件三、相分辨熒光的分析應(yīng)用1、熒光體兩組分混和物中個別組分的熒光光譜的直接記錄和熒光壽命的測定2－對－甲苯氨基－6－萘磺酸〔TNS〕和6－丙酰－2－〔二甲基氨基〕萘〔PRODAN〕混合物在乙醇溶液中穩(wěn)態(tài)熒光光譜相靈敏熒光光譜調(diào)整

DPRODAN被抑制TNS的熒光光譜，

=3.6nsTNS被抑制PRODAN的熒光光譜，

=11.6ns當(dāng)當(dāng)精選課件TNS和PRODAN的穩(wěn)態(tài)熒光光譜精選課件TNS-PRODAN混合物的相靈敏熒光光譜精選課件從混合物直接記錄下的TNS和PRODAN的熒光光譜精選課件2、溶劑松弛的相分辨在溶劑松弛過程中，一般情況能量有些降低，松弛態(tài)發(fā)射光譜紅移。但降低溫度會使光譜藍(lán)移。N-乙?；?L-色氨酸胺〔NATA〕solvent:丙稀甘油〔1〕不同T下的熒光光譜〔2〕相靈敏熒光光譜在固定D即t下所得到的熒光光譜精選課件NATA在丙烯甘油中的熒光光譜精選課件NATA在丙烯甘油中的相靈敏熒光光譜精選課件4-6熒光動力學(xué)分析法〔FluorescentKineticAnalysis)精選課件一、動力學(xué)法原理由于化學(xué)反響的速率與反響物的濃度有關(guān)，在某些情況下與催化劑的濃度有關(guān)，因此可以通過測量反響的速率以確定待側(cè)物的含量。光度法電位法熒光法測速率以熒光法監(jiān)測反響速率，這種方法那么稱為熒光動力學(xué)分析法。精選課件aA+bBnC+mD=k[A]a[B]ba=1b=1=k[A][B]精選課件1、熒光動力學(xué)分析的特點〔1〕優(yōu)點a.只觀測反響初期的速率，可用于某些反響速率慢、平衡常數(shù)小或可能發(fā)生副反響的化學(xué)反響；b.動力學(xué)分析是一種相對測量,動力學(xué)分析法有可能比平衡法具有更好的選擇性;c.靈敏度高、操作較快、易于實現(xiàn)自動化。精選課件〔2〕局限性a.所使用反響的半衰期應(yīng)在5ms到1h之間;b.必須嚴(yán)格地控制溫度、pH、試劑濃度、離子強(qiáng)度等反響條件和其它可能影響反響速率的因素；c.動力學(xué)測量的信噪比在本質(zhì)上要比平衡法小,只有反響的一小局部用于測定；d.試樣基質(zhì)的干擾問題仍可能發(fā)生,如降低有效濃度,與分析物結(jié)合。精選課件2、熒光動力學(xué)分析法非催化法催化法酶催化法〔1〕非催化法通過測量非催化反響的速率而測定某種反響物的濃度。精選課件〔2〕催化法以催化反響為根底來測定物質(zhì)含量的方法。催化反響速率與催化劑的濃度成正比，因此可測定催化劑的濃度，也可用于測定某些對催化反響起助催作用或抑制作用的物質(zhì)。例:8-羥基喹啉-5-磺酸+過硫酸銨Ag+精選課件(3)酶催化法基于酶催化的反響，這類反響的突出優(yōu)點是它的特效性和高靈敏度,不僅可用來測定酶的活性,也可用來測定底物、活化劑和抑制劑.精選課件3、反響速率的熒光法監(jiān)測假設(shè)化學(xué)反響的某種反響物或產(chǎn)物是熒光物質(zhì),便可利用熒光法來監(jiān)測反響的速率。記F-t曲線可通過正切法(斜率法)或固定時間法或固定熒光強(qiáng)度法獲得校正曲線。精選課件〔1〕正切法從F-t曲線求反響速率然后用作圖c精選課件(2)固定時間法使反響準(zhǔn)確地進(jìn)行到某一固定的時刻t，立即測定F,得到F-c曲線cF精選課件(3)固定熒光強(qiáng)度法測量熒光強(qiáng)度的變化值到達(dá)某一規(guī)定值所需的時間t，得到1/t-c曲線。c1/t精選課件熒光動力學(xué)分析法的優(yōu)點：靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬缺點：