魚類免疫學概述

魚類免疫學概述

天津市水產養(yǎng)殖病害防治中心2008.12.011

前言

魚類具有與高等脊椎動物相似免疫防御系統(tǒng)調控基因及基因控制產物，具備機體行使免疫功能的組織、細胞及分子基礎。魚體免疫組織除了分布于胸腺、脾臟及頭腎等器官中的系統(tǒng)淋巴組織（Systemiclymphoidtissue）外，還包括分布于皮膚、鰓和腸等器官中的黏膜相關淋巴組織,又稱為粘膜淋巴組織（mucosa-associatedlymphoidtissue,MALT），它們共同構建了魚體免疫的物質基礎

）。

魚類的系統(tǒng)淋巴組織一般是由網狀細胞作為框架支撐著能遷移或不能遷移的細胞群所構成，具有一定的組織結構，其中的主要細胞群是行使淋巴組織特異性和非特異性免疫防御的主要功能細胞，如：B、T淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。與系統(tǒng)淋巴組織相比，魚類粘膜免疫系統(tǒng)的組織細胞學基礎研究還不深入，其組織結構及功能細胞沒有被充分認識，特別是鰓及皮膚免疫組織的相關研究則更為薄弱，一定程度上阻礙了魚類免疫學的發(fā)展及免疫技術的應用。2魚類免疫學的幾個重要概念

1.免疫（immune，immunis）：

機體免疫系統(tǒng)對抗原物質的一種生物學應答過程。2.免疫應答：

是指魚體淋巴組織中的免疫細胞對內外環(huán)境的抗原信號的反應過程，是免疫系統(tǒng)的本質功能，包括特異性免疫應答和非特異性免疫反應。3.特異性免疫應答：

特異性免疫應答是指，魚類系統(tǒng)免組織接受抗原信號后，其中的免疫活性細胞會產生對抗原識別及呈遞、細胞的活化、增殖、分化等一系列復雜的生物學反應過程，最終體內產生抗體，發(fā)生特異性免疫效應，特異性免疫應答具有特異性、多樣性、免疫記憶和自身調節(jié)的特點。

34.非特異免疫應答：

魚類免疫系統(tǒng)免疫組織接受內外援信號刺激后，其中先天存在的天然防御機制也會發(fā)揮作用，產生非特異性免疫應答，其特點為非特異性、反應強度弱及不具有免疫記憶等(Dalmoetal.,1997)。5.特異性免疫與非特異性免疫應答的關系：與哺乳動物相似，魚類系統(tǒng)組織的特異性和非特異性免疫應答，是密切相關的一對免疫過程，兩者相互協(xié)同、彼此加強,兩者具有部分相同的功能細胞，例如巨噬細胞，其既可以行使非特異性免疫的吞噬功能，同時其在特異性免疫中又具有抗原吞噬、加工、處理及呈遞的功能(Yano,1996；安慶云，1998)。6.系統(tǒng)免疫組織及系統(tǒng)免疫應答：除了分布于胸腺、脾臟及頭腎等器官中的免疫組織成為系統(tǒng)淋巴組織（Systemiclymphoidtissue），由其承擔的免疫應答反應為系統(tǒng)免疫應答。

47.粘膜免疫組織及粘膜免疫應答：

分布于皮膚、鰓和腸等器官中的粘膜相關淋巴組織,又稱為粘膜淋巴組織（mucosa-associatedlymphoidtissue,MALT），它們共同構建了魚體免疫的組織細胞學基礎（Dalmoetal.,1997;Delamare-Debouttevilleetal.,2006;Cainetal.,2000;Romboutetal.,1993）。由其承擔的免疫應答反應為粘膜免疫應答。5

魚類免疫學領域中的幾個重要科學問題1.魚類粘膜免疫1.1魚類粘膜免疫的組織、細胞及分子學基礎

1.1.1皮膚

組織細胞學基礎：

魚類皮膚中存在淋巴細胞等白細胞；一些硬骨魚類的皮膚中存在特異性免疫功能細胞已經被直接或間接證據所證明。雖然不能確定這些細胞是皮膚組織發(fā)育的“本土細胞”還是源于其它組織的遷入細胞，但是為魚類免疫學家提供了遐想的空間和研究的學術節(jié)點。因此，魚類皮膚的特異性免疫的組織細胞學基礎研究已經成為了魚類免疫學研究熱點之一。

免疫因子：

Fletch和Gant通過口服和注射接種方式免疫鰈魚（Pleuronectesplatessa）后，在其皮膚粘液中檢測到免疫球蛋白；Lobb等從羊頭鯛皮膚粘液中分離出二聚體和四聚體的Ig。魚類皮膚組織及其分泌粘液中存在著多種非特異性免疫因子，目前得到證實的因子包括：溶菌酶、水解酶、轉移因子、C-反應蛋白、幾丁質、凝集素、抗菌肽等。

61.1.2鰓免疫組織與細胞：上皮細胞與支持細胞之間形成竇狀隙中，可以觀察到中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等白細胞；Davidson等（1997）對黃蓋鰈（Limandalimanda）灌注后的鰓進行活細胞分離，通過ELISPOT方法檢測離體活細胞中存在抗體分泌細胞(AntybodySecretingCell,ASC)，認為黃蓋鰈鰓組織中存在一定數(shù)量的能夠分泌抗體的B細胞。免疫因子：Lumsden等（1995）采用注射和浸泡免疫鱒魚（Salvelinusfontinalis）后，在免疫魚的鰓表收集粘液中檢測到同血清抗體免疫原性相同的抗體蛋白；王輝等（2007）從牙鲆(Paralichthysolivaceus)鰓組織中提取出能夠抑制鰻弧菌和金黃色葡萄球菌生長的抗菌肽；華育平等（2005）認為史氏鱘的鰓組織中存在溶菌酶。

71.1.3腸免疫組織與細胞：比較解剖學研究結果表明，大量的白細胞群分布于腸道粘膜組織中；Romano等（1997b）及Heidi（2005）對鯉魚、Santos等（1997）、Scapigliati(1999)對鱸魚的腸單細胞懸液中的白細胞進行單抗間接熒光標記及流式細胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，魚腸組織中存在一定數(shù)量B、T細胞。免疫因子：諸多學者已經證明魚類腸道內分泌粘液（Jonesetal.,1999;Hartetal.,1988;Joostenetal.,1997;Esteve-Gassentetal.,2004）及膽汁（Romboutetal.,1986;Lobbetal.,1981b;Jenkinsetal.,1994;Vervarckeetal.,2005）中存在抗體蛋白；Mulder等（2007）認為，在虹鱒魚腸粘膜組織中存在能夠合成干擾素IL-1b，IL-8,TNF-α和IFN-γ的功能細胞；另外，一些學者還在腸組織檢測到一些非特異免疫因子，如補體（Langeetal.,2004）、蛋白酶及溶菌酶等（Magnadóttiretal.,2005；華育平等，2005）。

81.2粘膜免疫應答

與魚類系統(tǒng)免疫應答相似，魚類粘膜免疫應答也包括特異性免疫應答和非特異性免疫兩種方式，兩者相互協(xié)同、彼此加強,共同行使魚類粘膜免疫系統(tǒng)的免疫防御功能。與魚類系統(tǒng)組織的非特異免疫功能相比，粘膜組織的非特異免疫作用更為重要。

91.2.1魚類粘膜組織的非特異性免疫

第一，皮膚、鰓及腸粘膜組織粘液的分泌及其對侵襲原的粘附應答：魚類的皮膚、鰓是與環(huán)境接觸最密切的器官，腸粘膜組織與腸腔環(huán)境接觸也很密切，因此在其表層的表皮粘膜組織層可以作為生理屏障護被著魚體，直接阻止外源性生物及有害物質的侵入。在外界環(huán)境因子改變后或在刺激原刺激下，粘膜組織中的粘液細胞可以對環(huán)境刺激產生粘液分泌應答，達到保護魚體免受傷害的作用。研究表明，粘膜組織分泌粘液的量值與環(huán)境因子的刺激強度有著直接的關系，同時，粘液的粘附能力與刺激原的種類有關系，例如，魚類的體表粘液和腸道粘液對不同種類細菌的粘附能力具有明顯差異性，該研究結果可以作為魚病防治以及腸道有益菌的篩選的依據。

10第二，細胞吞噬應答：

一些學者在研究粘膜免疫組織對抗原的攝取時發(fā)現(xiàn)，皮膚的上皮細胞對顆粒或大分子具有吞噬能力，鰓及后腸中的巨噬細胞、單核細胞及粒細胞也能吞噬顆?；虼蠓肿?，在一定物質刺激下或環(huán)境條件改變后，這些細胞的吞噬活性會發(fā)生相應的變化。Clerton等認為，在大劑量維生素E的刺激下，虹鱒腸道粘膜組織中的白細胞的吞噬活性明顯增強，并推斷這可能與維生素E能增強吞噬細胞膜的流動性有關。另外，F(xiàn)lano等（1996）發(fā)現(xiàn)虹鱒魚體外培養(yǎng)的鰓組織在受到細菌刺激后，嗜曙紅粒細胞(eosinophilicgranulecells,EGCs)數(shù)量明顯增加。Woo認為EGCs能在魚類鰓和腸等粘膜部位參與宿主對蠕蟲的非特異性免疫應答。11第三，粘膜組織及其分泌粘液中非特異性因子的應答：研究表明，魚類粘膜組織及其分泌粘液中的溶菌酶、干擾素等非特異性因子對侵襲原能夠產生非特異性免疫應答。Mulder等采用細菌(Aeromonassalmonicida)懸液浸泡感染虹鱒魚后發(fā)現(xiàn)，魚腸粘膜組織中合成IL-1b，IL-8,TNF-α和IFN-γ等干擾素的功能細胞數(shù)量明顯增加。Lindenst等則認為寄生蟲的感染強度與虹鱒魚皮膚粘膜組織中的干擾素IL-1β的表達存在著密切的關系，推斷寄生蟲感染可以誘導皮膚粘膜組織產生獨立的非特異性免疫應答。華育平等研究表明，史氏鱘感染嗜水氣單胞菌后，消化道和鰓組織中及體表粘液中的溶菌酶含量發(fā)生明顯變化，并且組織和粘液中溶菌酶含量與環(huán)境溫度存在著密切的關系。

121.2.2魚類粘膜組織的特異性免疫應答

關于哺乳動物粘膜系統(tǒng)特異性免疫應答的研究已經比較清楚了，當抗原接觸粘膜組織后,可以引起局部的獨立免疫應答,并分泌特異性的IgA抗體進入體液及粘液中，產生免疫效果。魚類粘膜免疫系統(tǒng)是否能夠獨立完成特異性免疫應答，曾經一度引起了相當大的爭議。近年來，隨著研究的深入，越來越多的學者認為，魚類粘膜免疫系統(tǒng)可以不依賴系統(tǒng)免疫，獨立完成抗原分子的識別、呈遞及抗體分泌，進而獨立完成局部抵御病原入侵的特異性免疫應答。但是，由于魚類粘膜免疫應答研究起步較晚，因此該領域還存在著諸多薄弱點。第一，皮膚、鰓和腸三種粘膜組織特異性免疫的研究水平不同，一些粘膜組織（如皮膚）研究水平比較低。第二，粘膜組織特異性免疫應答研究不系統(tǒng)，對B細胞的免疫應答及Ig的分泌動力學研究較多，對抗原的識別和呈遞則不足。第三，對不同種類魚的粘膜特異性免疫應答研究水平存在差異。

131.2.2.1皮膚的特異性免疫應答

一些學者研究結果為皮膚粘膜組織具有特異性免疫應答功能提供了間接依據。最有力的證據來自Xu等人的工作，他們對經小瓜蟲（Ichthyophthiriusmultifiliis）感染后的河鯰皮膚（已經去除蟲體）進行離體培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)液中可以檢測到針對小瓜蟲的特異性抗體蛋白，分子量與血清中的免疫球蛋白一致，認為皮膚在抗原刺激后可以獨立產生特異性免疫應答。另外，Esteve-Gassent等對經過免疫后的歐洲鰻、Cain等對虹鱒及Rambout等對鯉魚的研究結果表明，免疫魚的體表粘液中抗體蛋白呈現(xiàn)出與血清抗體蛋白不同的免疫應答動力學規(guī)律。上述研究結果一定程度上證明了魚類皮膚粘膜組織可以獨立完成特異性免疫應答。

141.2.2.2鰓的特異性免疫應答

目前對于魚類鰓粘膜組織的特異性免疫應答的研究比較系統(tǒng)，研究內容涉及抗原的識別和呈遞、抗體分泌細胞對特定抗原的應答以及鰓表粘液抗體應答動力學等內容。（1）鰓的抗原的識別和呈遞：抗原的識別及呈遞是特異性免疫應答的關鍵環(huán)節(jié)，特別是由T細胞參與的情況下更為重要?？乖淖R別和呈遞主要是由巨噬細胞完成的，鰓組織中的巨噬細胞識別并吞噬進入體內的抗原，然后對抗原進行加工呈遞。

Morrison等用Neoparamoebasp.懸液人工浸泡感染大西洋鮭后，采用免疫組化原位標記的方法，在被感染魚的鰓粘膜組織中檢測到主要組織相容復合體Ⅱ類分子陽性細胞，并且陽性細胞中組織相容復合體Ⅱ類分子的表達量呈現(xiàn)一定動態(tài)規(guī)律，進而推斷魚類的鰓粘膜組織中MHCⅡ的表達是在高度調控下完成的，這類似于哺乳動物粘膜組織的抗原呈遞方式。

15（2）鰓粘膜組織中免疫蛋白分泌細胞對特定抗原的應答：

Santos等采用一種全菌（Photobacteriumdamselaespp.）疫苗浸泡免疫石齒鱸(Dicentrarchuslabrax)幼魚，然后檢測不同時間點上免疫魚鰓組織中的抗體分泌細胞（AntibodySecretingCell,ASC）的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)免疫魚鰓組織中ASC數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的應答動力學規(guī)律。Davidson等（1997）用人免疫球蛋白注射免疫黃蓋鰈（Limandalimanda）后，檢測灌注鰓組織及外周血中ASC數(shù)量，結果表明鰓組織中ASC數(shù)量呈現(xiàn)出與外周血不同的應答動力學規(guī)律。

16（3）鰓表粘液抗體應答動力學：作為鰓粘膜組織存在特異性免疫應答的間接依據，魚類鰓表粘液特異性抗體的免疫應答規(guī)律已經被一些學者發(fā)現(xiàn)。至今在免疫后的非洲鯰魚（Clariasgariepinus）、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）及石齒鱸(Dicentrarchuslabrax)等鰓表粘液中存在針對免疫原的特異性抗體應答動力學規(guī)律，并且與血清抗體應答動力學呈顯著差異。

171.2.2.3腸粘膜免疫組織的特異性免疫應答（1）抗原的識別和呈遞：

魚類腸組織中存在類似于哺乳動物的M細胞的巨噬細胞，主要分布在后腸組織中，具有抗原的識別、攝入和加工的功能。腸道中顆粒狀或大分子抗原首先由上皮層包裹，然后傳遞到巨噬細胞所在的組織層，巨噬細胞識別并吞噬抗原，然后對抗原進行加工呈遞。與鰓相似，腸粘膜組織的抗原處理及呈遞的具體機制還不甚清楚，相關的研究報道很少。Koppang等用滅活全菌疫苗腹腔注射免疫大西洋鮭后，通過RT-PCR的方法檢測免疫魚后腸組織中MHCⅡβ鏈表達水平發(fā)現(xiàn)，免疫魚的后腸組織中MHCⅡβ的基因表達高于對照魚，但是差異不顯著。因此，根據現(xiàn)有研究結果只能推斷腸粘膜組織中存在抗原處理及呈遞過程。

18（2）腸粘膜組織中免疫蛋白分泌細胞對抗原的應答：Bermúdez等采用人工感染的的方法使大菱鲆感染粘孢子蟲（Enteromyxumscophthalmi）并表現(xiàn)典型的粘孢子蟲病癥狀，然后原位檢測病魚和對照魚腸組織中的Ig+細胞的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)患病魚的腸固有層中的Ig+細胞數(shù)量顯著高于對照魚，并且隨著蟲體感染強度的增加，Ig+細胞數(shù)量呈明顯的增加趨勢，認為魚類的腸粘膜組織中的Ig+細胞對體內寄生蟲存在明顯的免疫應答。然而，一些學者用全菌疫苗浸泡免疫石齒鱸后，腸組織中抗體分泌細胞則沒有出現(xiàn)明顯的免疫應答，這可能與浸泡接種抗原對魚體腸組織的刺激弱有關系。

19（3）腸表粘液及膽汁抗體應答動力學：

研究表明，在注射和肛門灌注免疫后的非洲鯰魚和鯉魚的膽汁中、口服和肛門灌注免疫后的鰻魚的腸表粘液中以及注射和口服免疫后的虹鱒的腸表粘膜粘液中都呈現(xiàn)出與血清不同的抗體免疫應答動力學規(guī)律。因此，多數(shù)學者認為，通過抗原對腸組織進行有效刺激（腸道感染病原、口服或肛門灌注疫苗），魚類腸表粘液和膽汁中可以產生Ig特異性免疫應答。201.2.2.4皮膚、鰓和腸粘膜免疫組織特異性免疫應答的相互關系

：一些學者在研究非洲鯰魚粘膜組織對注射、浸泡、口服及肛門灌注全菌疫苗的免疫應答時發(fā)現(xiàn)，后腸粘膜組織對抗原的識別、攝入可以對遠離腸組織的鰓和皮膚粘膜組織產生有效的抗原刺激，進而誘導鰓和皮膚產生粘膜特異性免疫應答，因此，他們認為在非洲鯰魚的體內存在著一個公共粘膜免疫系統(tǒng)（commonmucosalimmunesystem），不同的粘膜組織免疫應答之間存在著某種聯(lián)系，而這種聯(lián)系不是通過系統(tǒng)免疫介導的。

211.3魚類粘膜特異性免疫與系統(tǒng)特異性免疫的關系

1.3.1兩系統(tǒng)間免疫細胞的比較魚類粘膜免疫組織中存在種類齊全的免疫功能細胞，細胞種類及功能與系統(tǒng)免疫系統(tǒng)相似，然而，魚類系統(tǒng)免疫與粘膜免疫系統(tǒng)在發(fā)育及進化中的關系和先后順序尚未確定，因此，無法確定粘膜系統(tǒng)中的免疫細胞是由粘膜組織自身細胞分化而來還是由系統(tǒng)免疫組織的遷入。魚類組織胚胎學研究結果表明，魚類胸腺是由第二鰓囊發(fā)育而成，一定程度上可以推斷鰓粘膜組織可能先于胸腺組織進化，而鰓粘膜組織中免疫細胞可能是由自身組織細胞分化而來。一些研究結果則暗示粘膜系統(tǒng)中的免疫細胞是源于其它組織細胞的遷入，研究者認為在某些誘導白細胞遷移的化學因子作用下，其它組織中（包括血液）的白細胞易遷入粘膜組織中，而不易從粘膜組織遷出，進而成為粘膜組織的組成細胞。

221.3.2兩系統(tǒng)間免疫因子的比較關于魚類粘液Ig與血清Ig是否為同一抗體蛋白目前仍存在一定的爭議，多數(shù)研究表明，魚類粘液中抗體的免疫原性、結構及理化性質與血液抗體具有很強的相似性，兩者為同一種抗體蛋白。Lobb等（1987）將斑點叉尾鮰浸泡在含有DNP標記的馬血清蛋白溶液，以刺激斑點叉尾鮰產生特異性抗DNP標記抗白蛋白的抗體，結果發(fā)現(xiàn)從皮膚粘液中分離純化的抗體和血清中的抗體在半體共價結合方式和輕鏈或重鏈方面，都沒有明顯的區(qū)別。

另外一些研究表明，一些魚類的粘液抗體蛋白與血清中的抗體蛋白在結構、理化性質及免疫原性等方面，都存在著明顯的差異，兩者不是同一種抗體蛋白。

231.3.3兩系統(tǒng)間特異性免疫應答的關系

一些學者認為，魚類的粘膜免疫系統(tǒng)不能完成或至少不能夠獨立完成特異性免疫應答，依據為：首先，腹腔注射免疫后,一些種類魚體的粘液抗體雖然顯著增加，但其變化動力學規(guī)律與血清抗體一致，表明粘液抗體主要來源于系統(tǒng)免疫應答（Cainetal.，2000；LaFrentzetal.，2002）；其次，浸泡免疫后，體表粘液中針對疫苗的抗體水平沒有明顯增加趨勢，暗示粘膜組織沒有產生特異性免疫應答(Grabowskietal.，2004；Santosetal.，2005)。但是，浸泡免疫后體表粘液中抗體含量不增加，有可能與兩系統(tǒng)產生抗體種類差異及檢測方法有關；注射免疫后血清抗體也有可能伴隨分泌物轉移到表粘液，進而對粘液中抗體動力學產生影響。因此，這些研究結果都不足以作為否定粘膜系統(tǒng)獨立能夠完成特異性免疫應答的依據。

24

諸多者認為，粘膜免疫系統(tǒng)可以不依賴系統(tǒng)免疫系統(tǒng)，獨立完成特異性免疫應答：首先，浸泡免疫后，鰓、皮膚和腸粘膜組織首先產生較強烈的免疫應答，主要體現(xiàn)在粘膜組織表面粘液或膽汁中抗體水平的顯著增加以及組織中抗體分泌細胞數(shù)量顯著增加，而系統(tǒng)免疫應答較弱甚至檢測不到，并且應答時間比粘膜組織晚（Esteve-Gassentetal.，2004）；其次，注射免疫后，系統(tǒng)免疫首先產生很強免疫應答，而鰓、皮膚和腸粘膜組織則較弱甚至檢測不到（Vervarckeetal.，2005；Santosetal.，2000）；第三，口服或后腸灌注免疫后，腸粘膜組織中的抗體分泌細胞數(shù)量以及腸粘液和膽汁抗體水平顯著增加，腸道粘膜的抗體水平出現(xiàn)高峰的時間早于血清（Cainetal.，2000；Vervarckeetal.，2005）。252.魚類免疫接種方法

魚類免疫接種方法主要包括注射、浸泡、口服及后腸灌注。與哺乳動物相比，魚類免疫接種方法比較復雜，不同免疫接種方法所需的操作條件、可操作性以及對免疫對象產生的副作用各不相同，同時，不同免疫接種方法的免疫效果差異很大，因此，實際操作中，要根據免疫對象種類和數(shù)量以及免疫目的來選擇適當?shù)拿庖呓臃N方法。26