題目苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運用

2013屆本科生畢業(yè)論文（設(shè)計）題目苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運用作者姓名電帥指導(dǎo)教師吳元明二級學(xué)院醫(yī)學(xué)院專業(yè)藥學(xué)學(xué)號9B093139苯丙酮尿癥致病基因檢測方法優(yōu)化和運用摘要本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增和測序方法對一個確診的苯丙酮尿癥（PKU）家系的苯丙氨酸羥化酶（PAH）及6-丙酮酰四氫蝶吟合成酶（PTPS）的基因序列熱點突變位點及分布特征進行研究，優(yōu)化了苯丙酮尿癥致病基因檢測方法。結(jié)果表明：家系中父親和母親是苯丙酮尿癥致病基因PAH的突變攜帶者,兒子同時遺傳了父親和母親的突變基因，導(dǎo)致其患病，是典型的PKU家系，本研究為苯丙酮尿癥患者產(chǎn)前診斷、治療、遺傳咨詢、優(yōu)生優(yōu)育奠定基礎(chǔ)有重要意義。關(guān)鍵詞：PKU；PAH；PTPS；突變熱點Phenylketonuriapathogenicgenedetectionmethodoptimization

andapplicationAbstractThroughthepolymerasechainreaction(PCR)amplificationandsequencing，thisresearchdiscussedhotspotmutationsitesanddistributioncharacteristicsofthephenylalaninehydroxylase(PAH)and6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase(PTPS)genesinthephenylketonuria(PKU)family.Theresearchoptimizedthedetectionmethodsofphenylketonuriadiseasegenes.TheresultsshowedthatthemotherandfatherinthefamilywerethecarriersofPAHgene.Becauseofinheritingthegenesofthefatherandmotheratthesametime,thesonleadedtothePKU.Forphenylketonuriaprenataldiagnosis,therapy,geneticcounseling,prenatalandpostnatalcareofpatients,thestudylaidthefoundationforanimportantsignificance.Keywords:PKU;PAH;PTPS;Mutation目錄TOC\o"1-5"\h\z引言 -1-\o"CurrentDocument"1實驗材料 -3-樣本來源 -3 -\o"CurrentDocument"主要試劑 -3-\o"CurrentDocument"1.3主要儀器 -3-\o"CurrentDocument"實驗方法 -4-\o"CurrentDocument"2.1DNA提取 -4-\o"CurrentDocument"2.2PCR擴增 -4-\o"CurrentDocument"2.2.1PCR反應(yīng)體系 -4-\o"CurrentDocument"2.2.2反應(yīng)條件 -4-\o"CurrentDocument"2.3瓊脂糖凝膠電泳 -5-2.3.1瓊脂糖凝膠的制備 -5-2.3.2膠板的制備 -5-\o"CurrentDocument"加樣 -5-\o"CurrentDocument"電泳 -6-\o"CurrentDocument"觀察 -6-測序 -6 -\o"CurrentDocument"統(tǒng)計學(xué)分析 -6 -\o"CurrentDocument"實驗結(jié)果 -6-\o"CurrentDocument"4討論 -8-結(jié)論 -9-參考文獻 - 10-致 謝 -12-附 錄 -13-引言苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是一種氨基酸代謝異常的遺傳病。因其致病基因在常染色體上，所以發(fā)病幾率和性別無關(guān)［1］。根據(jù)發(fā)病機制不同，學(xué)者把苯丙酮尿癥分為兩個類型，一類是典型 PKU，病因是苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突變導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶缺乏所致，占全部疾病的98%?99%；另一類是四氫生物喋吟缺乏癥(tetrahydrobiopterindeficiency，BH4D)，病因是苯丙氨酸羥化酶的輔酶，四氫生物喋吟(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏所致，占1%?2%。PKU的主要臨床表現(xiàn)為，皮膚色淺、頭發(fā)細黃、虹膜淡黃色，同時尿有“發(fā)霉”臭味或鼠尿味，智力低下；而且60%患兒有腦電圖異常和繼發(fā)性癲癇［2］，嚴重者甚至可能導(dǎo)致死亡［3］。苯丙酮尿癥在全世界有廣泛的發(fā)病幾率，但也因地區(qū)及種族有明顯差異，發(fā)病率總體約為1：500－1：10000［4］。有文獻報道，苯丙酮尿癥發(fā)病率白種人大于黑種人和黃色人種。其中Turkey1：2600［5］、USA約為1：14000、theNorthernIsland約為1：4400、Germany約為1：7000、Japan約為1：78400［6］。根據(jù)國家新生兒篩查中心(Newbornscreening，NBS)提供數(shù)據(jù)顯示，我國新生兒苯丙酮尿癥發(fā)病率為1/11572［7］。而陜西省2004年－2009年的新生兒的苯丙酮尿癥發(fā)病率高達1/3425。也有文獻報道我國PKU發(fā)病存在著北方高于南方，東部地區(qū)低于中部和西部地區(qū)的特點［8］。苯丙酮尿癥作為可治療的遺傳代謝性疾病之一，若能達到早診斷、早治療，就能有效地控制該病的發(fā)生與發(fā)展，最大限度地減少社會和家庭的負擔，為提高我省人口素質(zhì)具有一定意義。PKU的致病基因的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1983年，苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因被成功分離、克?、?。苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因位于常染色體12q24.1,大約由1.5Mb堿基組成。PAH基因是割裂基因，編碼區(qū)包含13exons，同時被12introns所分隔。轉(zhuǎn)錄時剪接intron形成僅包含exon的1353bp的單鏈，即包含451密碼子的可譯框。信使核糖核酸(mRNA)翻譯成含451氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的PAH酶［10,11］。截至2011.5月，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)PAH基因的564種突變(http://www.mcgill.ca/pahdb)oPAH基因的突變大部分位于編碼區(qū)的基因的突變，在苯丙氨酸羥化酶基因中僅僅影響一個或多個氨基酸，其對酶活性的影響強烈依賴于突變的形式和位置，根據(jù)對苯丙氨酸羥化酶酶活性有無影響，突變又可分為致病突變和沉默突變。致病突變大多位于exon上，嚴重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯及蛋白質(zhì)的異常折疊、聚合，以及加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。沉默突變對苯丙氨酸羥化酶活性無影響。苯丙酮尿癥中5種重要的酶參與輔酶四氫生物喋呤的合成或代謝循環(huán)，可以說其中任何一種酶基因的缺陷均可導(dǎo)致BH4缺乏型PKU（即非經(jīng)典型苯酮尿癥,也稱惡性苯酮尿癥）。BH4是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等三種芳香族氨基酸羥化酶作用所必需的輔助因子，而6-丙酮酰四氫喋吟合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase,PTPS）是合成BH4的關(guān)鍵酶之一，其缺陷是BH4缺乏型PKU的最常見病因。盡管經(jīng)典PKU總發(fā)病率低于西方人，但有調(diào)查表明我國漢族人群BH4缺乏型PKU較西方人為多［12］。追溯到1986年就有通過生化手段進行BH4缺乏型PKU的產(chǎn)前診斷的報道，但因羊水中的生物蝶吟極不穩(wěn)定,PTPS酶學(xué)分析方法較復(fù)雜而使其應(yīng)用受到限制［13-15］,6-丙酮酰四氫喋吟合成酶（6-pyruvoyltetrahydropterinsynthase,PTPS）是BH4合成必需的催化酶，PTPS缺乏是導(dǎo)致BH4D的最主要原因。PTPS全長約9kb,共有6個exon，編碼145個氨基酸，已報道的突變主要分布在exon2、5、6。苯丙酮尿癥致病基因苯丙氨酸羥化酶和6-丙酮酰四氫喋吟合成酶基因突變具有以下特點：（1）突變位置多變：所有exon、intron、5,-UTR和3,-UTR區(qū)均發(fā)現(xiàn)突變。（2）突變類型多樣：有錯義突變（60.08%）、小缺失突變（13.35%）、剪接位點突變（11.03%）、沉默突變（7%）、無義突變（4.98%）、小插入（1%）、大片段插入罕見（＜1%）［11］，但大部分是錯義突變。（3）突變呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性，不同種族和地區(qū)人群之間基因座突變部位及分布具有較大差異。由于苯丙氨酸羥化酶和6-丙酮酰四氫喋吟合成酶基因僅在肝臟和腎臟中表達，故基因診斷是早期苯丙酮尿癥診斷的目前最有效的手段。目前國內(nèi)外對苯丙酮尿癥患兒的診斷實驗方法主要：Guthrie細菌抑制試驗、尿三氯化鐵試驗、血清苯丙氨酸濃度測定和尿蝶吟分析。這幾種生化檢測的方法耗時長且繁瑣，而且僅適用與已經(jīng)出生的嬰兒，對產(chǎn)前診斷無能為力。尤其對已生育過苯丙酮尿癥患兒的家庭，再次懷孕生育苯丙酮尿癥患兒的概率為25%的高危家庭，盲目生育導(dǎo)致悲劇發(fā)生的可能性極大?，F(xiàn)已對PKU患者的篩查和臨床檢驗已經(jīng)達到基因水平，如單鏈多態(tài)性PCR檢測（PCR-SSCP）、等位基因特異性寡核苷酸雜交法

（PCR-ASO）、限制性內(nèi)切酶的酶切（PCR-RFLP）、等位基因特異性擴增（ARMS）、短串聯(lián)重復(fù)序列（PCR-STR）及高壓液相色譜定量（HPLC）法等已經(jīng)應(yīng)用于臨床，這些實驗都為PKU的早期診斷和早期治療提供檢驗學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)。本課題采用序列分析的方法，選擇一個已出現(xiàn)過PKU患者的陜西家系進行PAH基因和PTPs基因的突變方法的優(yōu)化和研究，這些不僅有助于深入研究突變發(fā)生的分子機制，基因診斷、產(chǎn)前診斷、個性化治療、新藥開發(fā)提供重要的參考，并為制定出適合我省PKU患者孕前、產(chǎn)前診斷的最佳診斷篩查方案具有重要意義。實驗材料1.1樣本來源一個明確診斷的PKU家系:父母非近親婚配，均表現(xiàn)正常，已育有1子在出生后1月起病，表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難、驚厥、全身癱瘓和重度智力損害，且低苯丙氨酸飲食治療無效。生化檢查示患男其血苯丙氨酸〉20mg/dl6。1.2主要試劑1.2主要試劑全血DNA快速抽提試劑盒瓊脂糖DNAMarker、dNTPMixture、MgCl2TaqDNA聚合酶、TaqBufferDNAMarker、6"LoadingBufferEB1.3主要儀器德國QIAGEN天津科密歐化學(xué)試劑有限公司TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司天津科密歐化學(xué)試劑有限公司BECKMANBECKMAN公司BIO-RAD公司Microfuge22R離心機PTC-200PCR儀DYY-7型、DYCZ-20C型電泳槽DYY-12型電泳儀電源北京六一儀器廠實驗方法DNA提取(1)取EDTA抗凝血樣本300卩1于1.5ml離心管中，在血樣品中加入750卩1紅細胞裂解液CL充分顛倒混勻，12000rpm離心1min，小心吸去上清，重復(fù)以上步驟一次。向沉淀中加入150卩1的FG與1.5卩1蛋白酶K的混合液，迅速吹打混勻混勻，65°C水浴10分鐘。加入150卩1異丙醇，充分顛倒混勻(約20次)直至出現(xiàn)白色絮狀物。12000rpm離心5min，棄上清液留沉淀。向上一步沉淀中加入700卩1無水乙醇，12000rpm離心5min，棄上清液。加入200p1TB,65C水浴1小時。所得基因組DNA樣品測定分光光度值(OD260/OD280)。用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，-20C保存?zhèn)溆?。PCR擴增將提取的DNA分別進行PAH基因第3、5、6、7、11和12exon和PTPS基因第2、5、6exon的PCR擴增。PAH基因exon引物序列參考文獻［⑺、PAH基因exon引物序列參考文獻［18］,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。PCR反應(yīng)體系總體積20吐，其中含10X緩沖液，Mg2+2.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,上下游引物各0.5ymol/L,Taq酶1U,模板1吐。反應(yīng)條件94C預(yù)變性3min；94C30s,退火30s(退火溫度見表2-1),72C30s,

35個循環(huán)；72°C延伸5min,PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表2-1PKU致病基因exon引物序列基因引物序列 退火溫度（C）產(chǎn)物長度（bp）PAH-3FGCCTGCGTTAGTTCCTGTGAPAH-3RCTTATGTTGCAAAATTCCTCPAH-5FTCATGGCTTTAGAGCCCCCAPAH-5RAGGCTAGGGGTGTGTTTTTCPAH-6FCCGACTCCCTCTGCTAACCTPAH-6RCAATCCTCCCCCAACTTTCTPAH-7FTAGCGTCAAAGCCTATGTCCPAH-7RAAACCTCATTCTTGCAGCAGPAH-11FTGAGAGAAGGGGCACAAATGPAH-11RCCACCCACAGATGAGTGGCAPAH-12FTTCTCCAAATGGTGCCCTTCPAH-12RACTGAGAAACCGAGTGGCCTPTPs2FTTCTGACTCTCCCTTTGGTGAGCTPTPs2RGCATTCACACTGTGTCCGTAAGTT6030061基因引物序列 退火溫度（C）產(chǎn)物長度（bp）PAH-3FGCCTGCGTTAGTTCCTGTGAPAH-3RCTTATGTTGCAAAATTCCTCPAH-5FTCATGGCTTTAGAGCCCCCAPAH-5RAGGCTAGGGGTGTGTTTTTCPAH-6FCCGACTCCCTCTGCTAACCTPAH-6RCAATCCTCCCCCAACTTTCTPAH-7FTAGCGTCAAAGCCTATGTCCPAH-7RAAACCTCATTCTTGCAGCAGPAH-11FTGAGAGAAGGGGCACAAATGPAH-11RCCACCCACAGATGAGTGGCAPAH-12FTTCTCCAAATGGTGCCCTTCPAH-12RACTGAGAAACCGAGTGGCCTPTPs2FTTCTGACTCTCCCTTTGGTGAGCTPTPs2RGCATTCACACTGTGTCCGTAAGTT60300613546027364357602456227663252PTPs56FTAGTGGCTAAGTGATAAGGTGPTPs56RGAAAATGAAGTGATTTTTAATTTAT61 425PTPs56R2CAATAAATAGGCACTCCAGAGC2.3瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠的制備稱取0.5g瓊脂糖，置于三角燒瓶中，加入50ml0.5xTBE,置微波爐中加熱使其充分溶解，取出搖勻；膠板的制備將有機玻璃底板放入水平放置的制膠塑料模板中，垂直于玻璃板表面插入梳子。待瓊脂糖凝膠液冷卻到65C左右，加入12.5“l(fā)E液（10mg/ml）,將凝膠液緩慢的倒入玻璃底板上，室溫下靜置30min,直至凝膠完全凝固。小心的將梳子垂直拔出，將膠板置于電泳槽中。2.3.3加樣用微量移液器取PCR產(chǎn)物3卩1于干凈的塑料膜上，再加入1卩16xLoadingBuffer,用微量移液器吹打混勻，小心緩慢的將樣品加入到凝膠點樣孔內(nèi)。2.3.4電泳上樣完畢后，接通電源，電壓為120V，約20min后停止電泳。2.3.5觀察將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，打開紫外燈，觀察DNA條帶，拍照記錄（見圖2-1）。MaE2bE2aE3bE3aE5bE5ELE6LE6aE7bE7aEUbEllaE12bE12bE56圖2-1 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，EB染色2.4測序采用PCR產(chǎn)物直接進行正反向測序的方法，樣品純化及序列分析由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。所得序列與GenBank中正常人基因組序列比對，確定突變位點。2.5統(tǒng)計學(xué)分析選擇卡方檢驗，檢驗水準a=0.05，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗結(jié)果將實驗測序得到的苯丙氨酸羥化酶（PAH）的exon及其側(cè)翼序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中正常PAH基因序列進行比對，發(fā)現(xiàn)父親和母親均為PKU致病基因攜帶者，父親的突變位點是intron4上的c.442-lG>A,母親的突變位點是exon7上的c.728G>A，兒子分別遺傳了父母的突變基因，為復(fù)合雜合突變類型（見表3-1和圖3-1）,其中p.Arg243Gln為本次研究新發(fā)現(xiàn)（圖3-2B,C）,在國際PAH數(shù)據(jù)庫（http://www.mcgill.ca/pahdb）中尚未報到，提交并已被國際PAH基因突變數(shù)據(jù)庫收錄。另一苯丙酮尿癥致病基因PTPS在家系中均未檢測到突變。表3-1苯丙酮尿癥致病基因苯丙氨酸羥化酶基因突變檢測結(jié)果姓名核苷酸改變蛋白質(zhì)改變突變位置突變類型父親c.442-1G>A-I4剪接母親c.728G>Ap.Arg243GlnE7錯義兒子c.442-1G>A-I4剪接c.728G>Ap.Arg243GlnE7錯義圖3-1PAHintron4（I4）突變檢測的測序結(jié)果。紅色箭頭所指為突變位點。A：父親；B：母親；C:兒子。TTCCCTCCTTCCCTCCG圖3-2PAHexon7突變檢測的測序結(jié)果。紅色箭頭所指為突變位點。A：父親；B：母親;C:兒子。4討論PAH基因的突變大部分位于編碼區(qū)的小的遺傳學(xué)變化，在苯丙氨酸羥化酶基因中僅僅影響一個或多個氨基酸，其對酶活性的影響強烈依賴于突變的形式和位置。根據(jù)突變類型對PAH酶活性的影響情況，突變可分為致病突變和沉默突變兩種。沉默突變對PAH酶活性無影響。致病突變大多位于exon，嚴重影響PAH基因轉(zhuǎn)錄和翻譯及蛋白質(zhì)的異常折疊、聚合，以及加速降解，從而影響PAH的催化活性［19］。本研究共發(fā)現(xiàn)了2種突變，包括1種錯義突變和1種剪接位點突變。其中剪接位點突變和由于直接影響了蛋白的轉(zhuǎn)錄或翻譯，通常被認為是致病性突變，而錯義突變的致病性質(zhì)是需要經(jīng)過體外表達、蛋白結(jié)構(gòu)分析等進一步研究證明［20］。本研究的家系中PTPS基因沒有顯示突變，由于PTPS缺陷所致PKU發(fā)病率低，對一個家系而言突變是相對固定的。但是對于PTPS缺陷癥進行產(chǎn)前基因診斷，可以對先證者和父母的突變分析的基礎(chǔ)上，選擇合適的分子生物學(xué)手段，如以PCR人工增加限制酶位點、DNA序列分析和最新發(fā)展的DNA芯片等技術(shù)，這樣就可以對絕大多數(shù)PTPS缺陷癥進行產(chǎn)前基因診斷。本課題對PKU患者PAH基因和PTPS基因突變位點的探討，為家系PKU的研究提供重要補充資料，為有效降低PKU發(fā)病率，提供可靠科學(xué)依據(jù)，對減少PKU患兒的發(fā)生，提高人口素質(zhì)具有重要意義，同時也為深入開展PKU的基因診斷、產(chǎn)前診斷以及今后的基因治療奠定了基礎(chǔ)。結(jié)論任何疾病的發(fā)生都是遺傳物質(zhì)和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。人類疾病基因和相關(guān)基因的定位、分離和克隆，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來了空前的機遇?；蛟\斷是伴隨著遺傳學(xué)和細胞分子生物學(xué)理論和技術(shù)迅速發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型診斷技術(shù)。在PKU疾病診斷過程當中，基因診斷為進一步的產(chǎn)前診斷，疾病篩查奠定基礎(chǔ)，將向著高穩(wěn)定性、高可靠性、高效率以及快速簡便經(jīng)濟的方向發(fā)展，相信最終將會造福人類。參考文獻顧學(xué)苑，新生兒篩查現(xiàn)狀和展望[J],廣東醫(yī)學(xué).2000,7,21(7):21-25.顧學(xué)范，苯丙酮尿癥的診斷和治療，廣東醫(yī)學(xué),2000,21(7):535-536.AntshelKM,WaisbrenSE.Timingiseverything,executivefunctionsinchildrenexposedtoelevatedlevelsofphenylalanine[J].Neuropsychology,2003,17(3):458-468.WooSLC,LidskyAS,GuttlerFD,GuttlerF,ChandraT,KathrynJH,Robson.Clonedhumanphenylalaninehydroxylasegeneandallowsprenataldiagnosisandcarrieddetectionofclassicalphenylketonuria.Nature,1983,306:151-155.R.A.Williams,C.D.Mamotte,J.R.Burnett,Phenylketonuria:aninbornerrorofphenylalaninemetabolism,Clin.Biochem.29(2008)31-41.ScriverCR,WatersPJ,SarkissianC,RyanS,PrevostL,Cote'D,NovakJ,TeebiS,NowackiPM.PAHdb:alocus-specificknowledgebase.HumMutat,2000,15:99-104.ScriverCR,HurtubiseM,KoneckiD,PhommarinhM,PrevostL,ErlandsenH,StevenH,SteversR,WatersPJ,RyanS,McDonaldD,SarkissianC.PAHdb2003:whatalocus-specificknowledgebasecando.HumMutat,2003,21:333-344.'羅超權(quán)?基因診斷與基因治療進展[M].第1版，河南:河南醫(yī)科大學(xué)出版社,2000:79-81.CabibS,PascucciT,ThebehavioralprofileofseverementalretardationinageneticmousemodelofphenylketonuriaBehavGenet,2003,33(3):301-310.顧學(xué)范?苯丙酮尿癥防治現(xiàn)狀及進展?實用兒科臨床雜志,2000,15(5):297-299.王慕逖.兒科學(xué).人民衛(wèi)生出版社,1996:140-142.HsiaoKJ,ChiangSH,LiuTTetal.TetrahydrobiopterindeficientphenylketonuriadetectedbyneonatalscreeninginTaiwan.In:CurtiusHC,GhislaS,BlauN,eds.Chemistryandbiologyofpteridines1989.Berlin:WalterdeGruyter,1990,402-407.NiederwieserA,ShintakuH,HaslerT,etal.Prenataldiagnosisof‘dihydrobiopterinsynthetase'deficiency,avariantformofphenylketonuria.EurJPediatr1986,145:176-178.BlauN,NiederwieserA,CurtiusH,etal.Prenataldiagnosisofatypicalphenylketonuria.JInherMetabDis,1989,12Suppl2:295-298.ShintakuH,FujiokaM,SawadaY,etal.Prenataldiagnosisof6pyruvoyltetrahydropterinsynthasedeficiencyinEastAsia.In:CurtiusHC,GhislaS,BlauN,eds.Chemistryandbiologyofpteridines1989.Berlin:WalterdeGruyter,1990.408-413.ScriverCR,HurtubiseM,KoneckiD,PhommarinhM,PrevostL,ErlandsenH,StevensR,WatersPJ,RyanS,McDonaldD,SarkssianC.PAHdb2003:whatalocus-specificknowledgebasecando.HumMutat,2003,21:333-344.IvaKaraLic'a,DavidMeilib,VladimirSarnavkac,etal.Genotype-predictedtetrahydrobiopterin(BH4)-res