GBT 43271-2023 木材鑒定 DNA條形碼方法

木材鑒定DNA條形碼方法2023-11-27發(fā)布 I引言 Ⅱ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4原理 5試劑 6儀器與設(shè)備 37試驗步驟 3 9鑒定報告 附錄A(資料性)木材DNA條形碼鑒定方法的常用條形碼類型及通用引物 7附錄B(資料性)木材DNA條形碼的序列一致性分析 附錄C(資料性)木材DNA條形碼序列的鄰接樹構(gòu)建 附錄D(資料性)木材DNA條形碼序列的最大似然樹構(gòu)建 參考文獻 I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由國家林業(yè)和草原局提出。本文件由全國木材標準化技術(shù)委員會(SAC/TC41)歸口。本文件起草單位：中國林業(yè)科學研究院木材工業(yè)研究所、中國科學院植物研究所、安徽農(nóng)業(yè)大學、中國中醫(yī)科學院中藥研究所、廣西大學、中華人民共和國張家港海關(guān)、山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、云南瀕科委司法鑒定中心、天津工業(yè)大學、中國檢驗認證集團天津有限公司、東陽市千百年紅木家具有限公司、北京天怡利華沉香技術(shù)研究院、山東巧奪天工家具有限公司、浙江精典木材檢測服務(wù)有限公司、浙江省木雕紅木家具產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心、山西紫檀臻品紅木家具有限公司。Ⅱ易執(zhí)法和國內(nèi)市場監(jiān)督管理的迫切需求。DNA條形碼方法為木材“種”水平鑒定提供了技術(shù)依據(jù)。為促進木材合法貿(mào)易，增強《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)履約能力，提升我國木材產(chǎn)業(yè)鏈監(jiān)管水平，進一步推動我國林業(yè)產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，特制定本文件。1木材鑒定DNA條形碼方法2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法下列術(shù)語和定義適用于本文件。來源于樹木的次生木質(zhì)部，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分組成。生物體基因組中用于物種鑒定的一段標準的、相對較短的、易擴增的DNA(deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸)序列。具有相同的形態(tài)學、生理學特征和一定自然分布區(qū)的生物群，為分類學基本單位。親緣關(guān)系相近的種的集合。木材標本xylariumwoodspecimens從樹木主干或枝條部位采集的以木質(zhì)部為主的包含完整樹木分類學及采集信息的植物樣本。剛伐倒后未經(jīng)干燥的木材。2位于樹干外側(cè)靠近樹皮部分的木材，一般含有生活細胞和儲藏物質(zhì)(如淀粉等)。邊材樹種是指心邊材顏色無明顯差別，木材通體顏色均一者。種是心材和邊材區(qū)別明顯的樹種。在熱能作用下以蒸發(fā)或沸騰方式排除木材水分的處理過程。聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction;PCR用于擴增位于兩段已知序列之間DNA的分子生物學技術(shù)。與特定DNA片段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸短片段，用于聚合酶鏈式反應(yīng)。Phred質(zhì)量分數(shù)Phredqualityscore評估測序反應(yīng)準確性的質(zhì)量指標，表示堿基信號錯誤概率。序列一致性sequenceidentity兩條序列在同一位點核苷酸完全相同的部分所占的比例。分子系統(tǒng)發(fā)育樹molecularphylogenetictree間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的樹狀圖。4原理DNA條形碼方法是通過從未知樣本(待檢樣本)中獲取標準化DNA區(qū)域的核苷酸序列，然后使用生物信息學方法將該序列與參考數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行對比，最終根據(jù)對比結(jié)果將樣本鑒定到物種水平。采用該方法的前提是條形碼序列的種內(nèi)差異要遠小于種間差異，即存在條形碼間隔。5試劑5.1所使用的水均應(yīng)符合GB/T6682的滅菌雙蒸水。除另有規(guī)定外，所用試劑溶液宜大體積配制、小3體積分裝后經(jīng)高壓滅菌后使用，不宜高壓滅菌的試劑應(yīng)采用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。5.3十六烷基三甲基溴化銨[hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB,C?H??(CH?)?NBr]。5.4乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA,C?H?N?O?)。5.5三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,C?HNO?]。5.7聚乙烯吡咯烷酮[polyvinylpyrrolidone,PVP-40,(C?H?NO)?o]。5.8二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT,C?HoO?S?)。5.10三氯甲烷(chloroform,CHCl?)。5.11異戊醇(isoamylalcohol,C?H??O)。5.12三氯甲烷：異戊醇(體積比24:1)。5.1470%乙醇(ethanol,C?H;O)。5.15蛋白酶K(proteinase5.18氯化鎂(magnesiumchloride,MgCl?)。5.19脫氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate,dNTP)。5.20瓊脂糖(agarose)。5.21電泳緩沖液TAE[由三羥甲基氨基甲烷、乙酸(aceticacid,C?H?O?)和乙二胺四乙酸組成]。6儀器與設(shè)備6.1超凈工作臺(平均風速0.25m/s～0.6m/s)。6.2低溫冷凍研磨儀(液氮環(huán)境-196℃)。6.3超低溫冰箱(一80℃)。6.4冰箱(-28℃~4℃)。6.5天平(精度為0.1mg)。6.6恒溫水浴鍋(工作范圍30℃~70℃)。6.8低溫高速離心機(可實現(xiàn)4℃離心，離心力9500g以上)。6.9分光光度計。6.11電泳儀。6.12凝膠成像系統(tǒng)。7試驗步驟7.1.1應(yīng)采用規(guī)范的實驗室操作措施有效避免或消除外源污染及交叉污染。47.1.2試驗前，將實驗室進行紫外消毒。DNA提取和PCR擴增試驗中，應(yīng)按照操作步驟合理分隔試驗區(qū)域，各區(qū)域的儀器和設(shè)備不應(yīng)混用，試驗操作需嚴格按照單一流向進行。試驗后，應(yīng)對與樣品接觸過的工作臺、儀器與設(shè)備等進行消毒處理。7.1.3根據(jù)樣品加工處理條件、保存狀態(tài)、存儲時間和取樣部位的差異，通過優(yōu)化DNA提取參數(shù)以提高DNA提取質(zhì)量和效率。經(jīng)干燥或長期存儲的樣品宜采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法，生材樣品宜采用DNA提取試劑盒方法。7.1.4木材DNA提取和PCR擴增試驗步驟中應(yīng)設(shè)置陰性對照。7.2取樣根據(jù)木材樣品實際情況，宜選擇生材、邊材位置，避免腐朽等缺陷。取樣質(zhì)量一般應(yīng)不小于2g(含水率為12%時)。樣品首先采用3%次氯酸鈉浸泡30min,然后切除樣品外層表面(1mm～3mm)以去除外源污染，再利用低溫冷凍研磨儀將樣品研磨成木粉。一般來說，樣品采集后盡快進行DNA條形碼分析，否則宜儲存在一80℃或液氮(一196℃)條件下。根據(jù)離心柱法或磁珠法DNA提取試劑盒說明書進行。7.3.2十六烷基三甲基溴化銨法操作步驟如下。a)細胞裂解：取約300mg木粉裝入離心管中，分別加入3mL木材DNA裂解液[0.03g/mLCTAB,100mmol/LTris-HCl(pH8.0),1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,0.02g/mL~0.06g/mLPVP,5mol/LDTT],顛倒混勻；55℃水浴5h。b)抽提：水浴結(jié)束后，向離心管中加入等體積三氯甲烷：異戊醇(24:1),顛倒混勻5min;9000g、4℃離心10min;吸取上層水相于另一無菌離心管中。重復(fù)此操作1次。c)沉淀：向裝有抽提后水相的離心管中加入等體積預(yù)冷的異丙醇(1/10體積3mol/L的乙酸鈉和終濃度為0.02mg/mL～1mg/mL的糖原),上下顛倒混勻，此時可能出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在一20℃冰箱中放置30min。d)洗滌：9000g、4℃離心10min,倒掉上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，置于室溫下晾干。e)溶解：向每管離心管中加入100μL無菌雙蒸水溶解DNA。f)純化：利用DNA模板純化試劑盒進行木材DNA純化。采用紫外分光光度法或熒光定量法等對木材DNA提取液進行濃度測定。7.5引物設(shè)計與PCR擴增7.5.1DNA條形碼選擇一般可選擇rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、ycfl等葉綠體DNA片段和細胞核核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS作為通用DNA條形碼。對于特定樹種類群，也可使用針對該類群開發(fā)的專屬DNA條形碼。5引物序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴增區(qū)無同源序列；引物長度一般為15bp～30bp;堿基盡可能隨機分布，GC含量宜為40%～60%;引物內(nèi)部應(yīng)避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物序列的3’端應(yīng)避免出現(xiàn)堿基A及3個以上的連續(xù)堿基。常用DNA條形碼類型及通用引物實例見附錄A。PCR操作流程如下。a)反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的體積可選擇20μL～50μL。當PCR反應(yīng)體系為20μL時，各組分的終濃度如表1反應(yīng)組分原濃度終濃度反應(yīng)體積(20μL)ddH?O10×PCR緩沖液MgCl?25mmol/L2.5mmol/LDNTPs2.5mmol/L0.15mmol/L正向引物反向引物b)反應(yīng)程序：反應(yīng)程序通?？刹捎茫?4℃預(yù)變性為90s,94℃變性5s,Tm-5℃退火30s(T。為引物熔解溫度),72℃延伸20s,循環(huán)40次，72℃終延伸5min,4℃保存待測。為提高擴增效率，可采用巢式PCR擴增。由于樣本的異質(zhì)性，應(yīng)根據(jù)樣本的實際情況調(diào)整反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。PCR完成后，可將PCR產(chǎn)物臨時存放于4℃冰箱，對于需長期保存的(一周以上)PCR產(chǎn)物應(yīng)置于一20℃冰箱保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測流程如下：a)稱取適量的瓊脂糖并加入電泳緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度1%～2%的溶液，加熱溶解；b)冷卻片刻，加入適量的核酸染料充分混勻，倒入放置好梳齒的膠槽中；c)待冷卻凝固后，垂直向上拔去梳齒，將制膠板移至電泳槽中；d)取2μL～5μLPCR產(chǎn)物進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。7.6DNA測序與序列拼接PCR產(chǎn)物純化后，以PCR擴增引物作為測序引物對DNA片段進行測序。6對測序結(jié)果進行質(zhì)量評估，去除序列兩端Phred質(zhì)量分數(shù)小于20的堿基和測序引物序列，然后將正向和反向互補序列組裝成一個完整序列。7.7DNA條形碼序列分析7.7.1序列一致性將獲得的DNA序列與參考數(shù)據(jù)庫進行比對，通過兩兩序列局部比對或者搜索短的核苷酸字符串來查詢數(shù)據(jù)庫中最匹配的樹種序列。參考數(shù)據(jù)庫應(yīng)已包含相關(guān)樹種的序列。序列一致性分析實例見附7.7.2分子系統(tǒng)發(fā)育樹將獲得的DNA序列與參考數(shù)據(jù)庫序列進行多重序列比對，根據(jù)優(yōu)選的建樹方法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并用重復(fù)抽樣檢驗方法評估分子系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建實例見附錄C和附當采用其他方法進行DNA序列分析時，應(yīng)說明該方法的具體步驟。8判定采用序列一致性方法時，若滿足序列最大一致性且唯一匹配條件，則判定為相應(yīng)樹種。采用分子系統(tǒng)發(fā)育樹方法時，若聚類為獨立分支，則判定為相應(yīng)樹種。當采用其他的序列分析方法時，應(yīng)說明具體判定依據(jù)和判定結(jié)果。當DNA條形碼序列分析無法判定相應(yīng)樹種，則應(yīng)給出科、屬等更高分類階元的鑒定結(jié)果。9鑒定報告鑒定報告應(yīng)包括木材樣品照片、樣品描述、試驗方法、判定依據(jù)及鑒定結(jié)果等內(nèi)容。7(資料性)木材DNA條形碼鑒定方法的常用條形碼類型及通用引物常用DNA條形碼類型及通用引物見表A.1。表A.1木材DNA條形碼鑒定方法的常用條形碼類型及通用引物引物名稱引物序列(5’-3’)適用范圍rbcLrbcLbFAGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGTrbcLbRTCGGTYAGAGCRGGCATRTGCCAmatKmatK472FCCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC被子植物(含闊葉樹)matK1248RGCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGCGym_FlAATYGYRCTTTTATGTTTACARGC裸子植物(含針葉樹)Gym_R1ATCAYCCGGARATTTTGGTTCGpsbA-trnHtrnHf_05CGCGCATGGTGGATTCACAATCCpsbA3fGTTATGCATGAACGTAATGCTCycf1bFTCTCGACGAAAATCAGATTGTTGTGAAT被子植物(含闊葉樹)ycf1bRATACATGTCAAAGTGATGGAAAAycflgFTGAAAGCTCTAAGCAATGGATCYCC裸子植物(含針葉樹)ycflgFATACGACCAATATTTTTRGCTATTATATGCGATACTTGGTGTGAATGACGCTTCTCCAGACTACAATCCTTATCAYTTAGAGGAAGGAGYGACTCTCGGCAACGGATAGCGTTCAAAGAYTCGATGRTTCRGTTTCTTTTCCTCCGCTTA8(資料性)木材DNA條形碼的序列一致性分析以常用DNA數(shù)據(jù)庫NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)為例。采用基于局部對比算法搜索工具(BLAST)的相似性搜索方法分析時，進入BLAST頁面，將所獲得的木材樣品DNA條形碼序列作為查詢序列置于“輸入查詢序列(EnterQuerySequence)”窗口中；選擇“選擇搜索設(shè)置(ChooseSearchSet)"中“標準數(shù)據(jù)庫(Standarddatabases)”,默認搜索范圍為“核苷酸數(shù)據(jù)庫(Nucleotidecollection)”;程序選擇(ProgramSelection)中推薦優(yōu)先選擇“高度相似序列(Highlysimilarsequences)”;點擊“BLAST”,獲得最大一致性，確定匹配唯一性，完成序列一致性分析(見圖B.1)。檢索結(jié)果Description▼ScientificCommonNameNameTaxidMaxTn!aQueryEvaluePerAccLerce55ionPhgebezhennaoucherJY10smallsubunitriboscmalRNAgene.Rarlialsequence;inlemal…Phoebe…NA9431011097210972100%0.0100.0045941MT828602.1PhoebeboumeivoucherSCH08smallsubunitribosomalRNAgene,partialsequence;intem.…Phoebe…NA460784109641096499%0.099.98%5941MT628616.1 PhoebehuivoucherZF49smallsubunitribosomalRNAgene.partialsequence:intemaltrans…Ehoebe…NA 480785108591085999%0.099.66% MT628645.1 PhoabeaspZF55smallsubunitribosomalRNAgene.partialssquonce;internaltranscribads…Phoabe…NA27455541082910829100%0.[]99.56% MT628648.1PhaebeshearerivoucherWHQ1smallsubunitribosomalRNAgene.partialsaquencs;intema…Phoebe…NA 480789108131081399%0.099.56% MT828621.1PhoebeshearenivoucherZF45smallsubunitribosomalRNAgene,partialsequence;intemal…Phoebe…NA460789108111081199%0.009.56%5934MT628643.CinnamomumcaudiferumyoucherFD24smallsubunitribosomalRNAgene..partialsequenc.…Cinnam…NA2745578105381053899%0.098.71%MT628595.1CinnamomumparthenoxylonvoucherYBO4smallsutunitnbosomalRNAgone.partialseque…Cinnam…NA 714455105211052199%0.098.65%5835 MT628624.1CinnamomumcanphoravoucherKZ05smallsubunitribosomalRNAgene.gartialsequence;…Cinnam…carmpha…13429104531045399%0.098.47%592BMT628606.1圖B.1基于木材DNA條形碼的序列一致性分析示例9(資料性)木材DNA條形碼序列的鄰接樹構(gòu)建以分子進化遺傳分析軟件(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis,MEGA1)中鄰接法(Neigh- bor-joiningmethod)為例。采用基于鄰接法的分子系統(tǒng)發(fā)育樹方法分析時，進入M (File)”菜單中選擇“打開文件(OpenaFile/Session)”,點擊MEGA主窗口“系統(tǒng)發(fā)育(Phylogeny)”菜單選擇“構(gòu)建/測試鄰接樹(Construct/TestNe統(tǒng)發(fā)育測試(PhylogenyTest)”菜單中選擇"自展法(Bootstrapmethod)",數(shù)值一般設(shè)置為1000;選擇“模型/方法(Model/Method)”"替換類型(SubstitutionsType)""位點進化速率(RatesamongSites)"和“空位處理(Gaps/MissingDataTreatment)”關(guān)系，完成分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(見圖C.1)。P.zhonngn01P.zhorngn_02P,zhonngn_42P.zhonnan_4P.zharnan_P.zlierinan_P.zliernan_9:P.cheklangensis_01?ly;PghekiangetsisnPthekiargesis04PshcureniorPshcarwi_03Pshcargni_4Pshsaror_05Pshearer_KX437773一F.asisne:e_KX437772P.newanfh9_AH394255ieeH3942iiba'anseeKT?he5!7pauhx_drhiepfspetde_q然Miepiphpt:Q7gicnisptpM:02ikfhunbcrgxikfhunbcrgx_6228|ikthunbergi_03ikthunbergx_04ikthunb6ngw_itt178404—Gnramomuncavghorg_6050970注：P-Phoebe楠屬，M-Machilus潤楠屬。 圖C.1基于木材DNA條形碼的鄰接樹構(gòu)建示例對這一產(chǎn)品認可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。(資料性)木材DNA條形碼序列的最大似然樹構(gòu)建以MEGA軟件中最大似然法(MaximumLikelihoodmethod)為例。采用基于最大似然法的分子系統(tǒng)發(fā)育樹方法分析時，進入MEGA界面，從“文件(File)”菜單中選擇“打開文件(OpenaFile/Session)”,點擊MEGA主窗口“系統(tǒng)發(fā)育(Phylogeny)”菜單選擇"構(gòu)建/測試最大似然樹(Construct/TestMaximumLikelihoodTree)”,選擇“數(shù)據(jù)類型(DataType)""選擇遺傳密碼(SelectGeneticCode)”相應(yīng)參數(shù)后進入“分析參數(shù)選擇(AnalysisPreferences)”窗口，在“系統(tǒng)發(fā)育測試(PhylogenyTest)”菜單中選擇"自展法(Bootstrapmethod)",數(shù)值一般設(shè)置為1000;選擇“模型/方法(Model/分子系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建(見圖D.1)。PrhennanfPzhervn_üg剖P.znsnngn_i剖P.zinsnngn_0cP.zhervar_rF.chgkiangansis_0lrchekianens:s_G2廣9;F.chgkiangansis_03chekxgensts_04F.chgkianganss_05F.chariangensis_KY34651!PsneatarF.shsara_02F.shsaa_04P.steurer_0tlrsngsan_KX437773—P.bcurxKY346512—FomeensisKX437772F:xurwtheN1334?5dP.neuranfngaH394303P.nsuraning_wH394353 gignss