環(huán)境樣品前處理第6章 衍生化課件

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化技術(shù)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1衍生化目的與條件過(guò)程：化學(xué)反應(yīng)→定量轉(zhuǎn)化→適于分析。定義：借助化學(xué)反應(yīng)將待測(cè)組份接上某種特定基團(tuán)，從而改善其檢測(cè)靈敏度和分離效果的方法。作用：把難于分析的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易于分析的物質(zhì)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)間接分析目標(biāo)化合物。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1衍生化目的與條件柱前衍生化：衍生化反應(yīng)→定量生成→色譜分析。柱后衍生化：色譜柱分離→衍生化反應(yīng)→檢測(cè)。分類：柱前衍生化和柱后衍生化。流程：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化機(jī)理柱前衍生化柱后衍生化分離-衍生產(chǎn)物檢測(cè)-衍生產(chǎn)物檢測(cè)-衍生產(chǎn)物分離-待測(cè)物本體衍生化環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.1衍生化的目的提高目標(biāo)物可檢測(cè)性：

LC:提高檢測(cè)靈敏度與選擇性

GC:改善色譜分離，通過(guò)增強(qiáng)目標(biāo)物揮發(fā)性或者改善目標(biāo)物極性

提高理化穩(wěn)定性為結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.2衍生化的條件柱前衍生化反應(yīng)需滿足的條件：①反應(yīng)迅速、定量、重復(fù)、條件不苛刻、易操作；②選擇性高、具有專一性；③反應(yīng)產(chǎn)物只有一種，無(wú)干擾；④衍生化試劑易得、通用性好。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.2衍生化的條件2.柱后衍生化反應(yīng)需滿足的條件：①反應(yīng)迅速、定量、重復(fù)；②反應(yīng)條件與色譜條件適應(yīng)；③反應(yīng)產(chǎn)物可檢測(cè)；

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.1氣相色譜柱前衍生化（1）硅烷化衍生化方法（2）酯化衍生化方法（3）鹵化衍生化方法（4）?；苌椒ǚ椒?.2衍生化方法環(huán)境樣品前處理第6章衍生化1.硅烷化衍生化方法本節(jié)首頁(yè)退出本章質(zhì)子性化合物如醇、酚、酸、胺等與硅烷化試劑反應(yīng)，形成揮發(fā)性的硅烷衍生物R3Si—X+H—R`R3Si—R`+H—XP135表6-1環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.酯化衍生化方法大多數(shù)有機(jī)酸揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差。在GC分析之前衍生為相應(yīng)的酯。①甲醇法②重氮甲烷法③三氟乙酸酐法酯化反應(yīng)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化①甲醇法本節(jié)首頁(yè)退出本章甲醇法：有機(jī)酸與甲醇在催化劑的存在下加熱，可以發(fā)生酯化反應(yīng)，生成有機(jī)酸甲酯RCOOH+CH3OH催化劑RCOOCH3+H2O△

硫酸、鹽酸-加熱

三氟化硼B(yǎng)F3-室溫催化劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化②重氮甲烷法本節(jié)首頁(yè)退出本章非水介質(zhì)中CH2N2與有機(jī)酸反應(yīng)，生成有機(jī)酸甲酯RCOOH+CH2N2RCOOCH3+N2重氮甲烷不穩(wěn)定，有爆炸性，有毒??！環(huán)境樣品前處理第6章衍生化③三氟乙酸酐法本節(jié)首頁(yè)退出本章醇或酚與有機(jī)酸反應(yīng)，生成酯：RCOOH+R'OHRCOOR'+H2O適合空間位阻較大的化合物。三氟乙酸酐環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.?；苌椒ū竟?jié)首頁(yè)退出本章

在-OH、-SH、-NH等含有活潑氫的化合物上引入酰基→轉(zhuǎn)化為弱極性的酯、硫酯或酰胺→改善揮發(fā)性和穩(wěn)定性，含有鹵離子的羰基基團(tuán)可增強(qiáng)ECD響應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：保護(hù)不穩(wěn)定基團(tuán)；提高糖類，氨基酸等物質(zhì)的揮發(fā)性和熱穩(wěn)性；有助于混合物分離；使用ECD檢測(cè)，分析物檢測(cè)下限可降低很多。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.?；苌椒ū竟?jié)首頁(yè)退出本章（1）乙?；ǎ禾岣邠]發(fā)性試劑：乙酸酐（AA）樣品：糖類介質(zhì)：多為非水催化劑：吡啶等堿性化合物環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.酰化衍生化方法本節(jié)首頁(yè)退出本章（2）多氟?；ǎ阂臌u素！試劑：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐（PFP）、七氟丁酸酐（HFB）、N-甲基雙（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI）

樣品：藥物等大分子介質(zhì)：非水環(huán)境樣品前處理第6章衍生化4.鹵化衍生化方法本節(jié)首頁(yè)退出本章引入鹵素→ECD檢測(cè)器→改善揮發(fā)性和穩(wěn)定性。（1）鹵素法：加成或取代

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化4.鹵化衍生化方法本節(jié)首頁(yè)退出本章（2）鹵化氫法：加成或置換

（3）NBS法：烯丙位取代

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環(huán)境樣品前處理第6章衍生化HPLC化學(xué)衍生化分類

在線化學(xué)衍生化

★是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)

離線化學(xué)衍生化

柱前衍生化

★發(fā)生衍生化發(fā)應(yīng)的先后

柱后衍生化環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁(yè)退出本章6.2.2液相色譜柱前衍生化1.紫外衍生化反應(yīng)2．熒光衍生化反應(yīng)

3．電化學(xué)衍生化反應(yīng)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化優(yōu)點(diǎn)：（1）對(duì)用作流動(dòng)相的溶劑體系沒(méi)有限制；（2）反應(yīng)條件，反應(yīng)速率不受限制；（3）通過(guò)選擇合適的試劑以及萃取方法，可以消除許多干擾；（4）過(guò)量溶劑、試劑容易除去；（5）轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進(jìn)。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化缺點(diǎn):（1）操作過(guò)程繁瑣，容易影響定量準(zhǔn)確性。（2）當(dāng)一個(gè)復(fù)雜組分樣品經(jīng)過(guò)衍生化反應(yīng)后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物給色譜分離帶來(lái)困難。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁(yè)退出本章（1）紫外衍生化反應(yīng)液相色譜法中，紫外吸收檢測(cè)器是最常見的一種高靈敏度檢測(cè)器很多化合物在紫外可見光譜區(qū)無(wú)吸收與帶有紫外吸收基團(tuán)的衍生試劑在一定條件下發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物帶有發(fā)色基團(tuán)而能被紫外吸收檢測(cè)器檢測(cè)。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁(yè)退出本章（1）紫外衍生化反應(yīng)苯甲酰氯

+胺、醇、酚→苯甲酸酯類衍生物（２００～３６０ｎｍ）（1）苯甲?；磻?yīng)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁(yè)退出本章（1）紫外衍生化反應(yīng)（2）苯甲磺?；磻?yīng)

（3）DNFB與醇、胺、氨基酸反應(yīng)（4）PITC與氨基酸反應(yīng)（5）有機(jī)酸酯化反應(yīng)

（6）羰基與DNPA或PNBA反應(yīng)

P139-140:更多反應(yīng)：P137-138表6-2環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（2）熒光衍生化反應(yīng)定義：用含有芳香環(huán)或雜環(huán)的大基團(tuán)取代被測(cè)化合物分子中的一個(gè)或幾個(gè)原子，以此將熒光物標(biāo)記入分子，此時(shí)被測(cè)分子的結(jié)構(gòu)基本不變特點(diǎn)：高選擇性、高靈敏度熒光檢測(cè)器靈敏度比紫外檢測(cè)器的靈敏度高10到1000倍環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（2）熒光衍生化反應(yīng)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化例：福多司坦血藥濃度測(cè)定方法的建立

2、半胱氨酸結(jié)構(gòu)式：1、福多司坦結(jié)構(gòu)式:

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

3、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：為半胱氨酸衍生物；沒(méi)有強(qiáng)的紫外吸收，沒(méi)有熒光；分子量小，極性大。羧基伯氨基環(huán)境樣品前處理第6章衍生化衍生化產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)為338nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm反應(yīng)過(guò)程：

參考氨基酸的測(cè)定方法，選擇合適的衍生化試劑衍生化后測(cè)定：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生試劑常用的熒光衍生化試劑（亦稱熒光探針）有：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生試劑的基本構(gòu)成取代基熒光團(tuán)（試劑分子母體）反應(yīng)基團(tuán)膽磺酰肼DNS-H環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生化試劑亦稱熒光探針P140表6-3常用的熒光衍生試劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化1.丹磺酰氯（1-二甲氨基萘-5-磺酰氯）

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.丹酰肼（1-二甲氨基萘-5-磺酰肼）

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生化試劑的分類：（一）胺的衍生試劑（二）醇、酚的衍生試劑（三）羰基化合物的衍生試劑（四）羧酸類化合物的衍生試劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化鄰苯二甲醛OPA4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑

NBD-Cl熒光素異硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯

6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯AQC（一）胺的衍生試劑：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（二）醇、酚的衍生試劑:羰基氯類：FMOC,CEOC磺酰氯類:DNs-Cl鹵代三嗪類:EDTN

1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

（三）羰基化合物的衍生試劑:肼類DNs-HCEOC-H

氨基類氨基甲基芘

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（四）羧酸類化合物的衍生試劑:

溴甲基類BrMMC

哌嗪基類DBD-Pz7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（四）羧酸類化合物的衍生試劑:

重氮甲烷基類ADAM

其它類

9-(2-羥乙基)-吖啶酮HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素(ADMC)9-蒽重氮甲烷環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

（3）電化學(xué)衍生化反應(yīng)樣品與某些試劑反應(yīng)，生成具有電化學(xué)活性的衍生物，以便在電化學(xué)檢測(cè)器上有較高的響應(yīng)。環(huán)境介質(zhì)對(duì)電化學(xué)反應(yīng)有很大影響，如離子強(qiáng)度、pH值和溶劑組成等。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

常用的電化學(xué)衍生化試劑：（1）帶硝基的芳香化合物：P141表6-4

（2）芳氨基、酚羥基等

上述試劑與羥基、氨基、羧基、羰基化合物反應(yīng)生成具有電化學(xué)活性的衍生物。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.3柱后衍生過(guò)程將樣品先注入色譜柱，按選定的色譜條件使樣品組分得以分離；當(dāng)各個(gè)組分從色譜柱流出后，分別與衍生化試劑相遇，在一定的反應(yīng)條件下，生成具有某種檢測(cè)特性的衍生化產(chǎn)物進(jìn)入檢測(cè)器測(cè)定。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

要求：（1）對(duì)流動(dòng)相的選擇更嚴(yán)格，必須考慮衍生化試劑、反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度，以及它們與流動(dòng)相可能發(fā)生的副反應(yīng)；（2）在高效液相色譜中采用高流速，因此

反應(yīng)速率必須很快（小于30s）；（3）檢測(cè)器對(duì)衍生化試劑不能有響應(yīng)。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化柱后衍生流程圖泵進(jìn)樣閥色譜柱衍生化試劑泵衍生化反應(yīng)器檢測(cè)器記錄儀環(huán)境樣品前處理第6章衍生化柱后反應(yīng)器毛細(xì)管式空氣分割式填充柱式P143圖6-2環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.4固相化學(xué)衍生化法

（1）還原型固相反應(yīng)劑

1.固相化學(xué)反應(yīng)劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.4固相化學(xué)衍生化法

酶是一種具有特殊三度空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)，能夠催化某一底物進(jìn)行特異性化學(xué)反應(yīng)，生成特定的反應(yīng)產(chǎn)物。酶的催化反應(yīng)具有高度的專一性酶試劑通常在反應(yīng)中是不消失的，可重復(fù)使用酶的固定化可分為化學(xué)和物理兩種方法，化學(xué)法是指在酶和載體之間生成共價(jià)鍵，并保留其生物活性，而物理方法僅是吸附在固體表面。2.固定化酶環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.固定化酶對(duì)載體的要求：對(duì)酶應(yīng)有較高的親和力和較大的容量、易再生。一般大孔徑、大表面積的載體容量大，而容量越大，固定化酶的活性越高，壽命越長(zhǎng)。硅球、玻璃微球、氧化鋁、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和纖維素等都可以作為載體。如纖維素或葡聚糖凝膠與溴化氰反應(yīng)，然后用酶處理：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.固定化酶酶一旦被固