第二章-電泳學基礎

第二章電泳學基礎一、定義及原理1、電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。2、原理電泳技術就是利用在電場作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、性狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純。遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的黏度成反比。3、應用：電泳技術除了用于小分子物質(zhì)(無機鹽、氨基酸、核苷酸、脂類)的分離分析外，最主要用于生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶)的研究。以生物大分子為例闡明電荷來源R╱╲COOHNH3+R╱╲COO-NH3+R╱╲COO-NH2+OH-

+H++OH-

+H+

pH>pIpH=pIpH<pI由于多數(shù)的電泳法設備簡單，操作方便，并具有高分辨率及選擇性特點，已成為生物化學與分子生物學中最常用技術之一。目前，電泳技術已廣泛應用于分析化學、生物化學、臨床化學、藥理學、免疫學、微生物學、遺傳學等科學中。二、電泳分類

（一）按有無固體支持物分類按有無固體支持物可以分為兩類：自由電泳和支持物電泳。1、自由電泳即溶質(zhì)在自由溶液中泳動。2、支持物電泳根據(jù)所用的支持物不同又可分為紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、根據(jù)支持載體的位置或形狀可分成：水平電泳、垂直電泳、板狀電泳、柱狀電泳、U型管電泳、倒V字形電泳、毛細管電泳等。4、根據(jù)支持物的特點又可分為：①無阻滯支持物電泳。②高密度的凝膠電泳。

1、區(qū)帶電泳

2、等速電泳

3、等電聚焦電泳

4、免疫電泳（二）按分離原理分類1、區(qū)帶電泳在眾多電泳技術中，最常用的為區(qū)帶電泳，同時也是最簡潔的電泳模式。推動離子/粒子作區(qū)帶電泳的驅(qū)動力為電場力（F），離子/粒子所受電場力的大小與離子/粒子的凈電荷（Q）和電場強度（E）呈正比關系，即：

（2.86）而離子/粒子在運動時會受到一定的溶液阻力（F’），對于球形離子/粒子，此阻力服從Stoke’定律，即

(2.87)在方程(2.77)中，r為離子/粒子的半徑，η為溶液或介質(zhì)的黏度，μ為泳動速度。泳動速度μ與離子/粒子的淌度m呈正比關系，即

(2.88)電泳淌度電泳淌度

(ElectrophoreticMobility)是單位場強下離子的平均電泳速度。因為電泳速度與外加電場強度有關，所以，在電泳中常用淌度而不用速度來描述荷電離子的電泳行為和特性。當電泳達到穩(wěn)態(tài)時，電動力等于介質(zhì)的阻力，即F=F’。因此，我們得到

(2.89)因此，將方程(2.78)和（2.79）的結合，我們得到(2.90)

帶電粒子的電泳淌度在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)，即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區(qū)帶電泳。

06-02平臥式電泳槽裝置示意圖將濾紙條水平地架設在兩個裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點于濾紙中央。當濾紙條被緩沖液潤濕后，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進行電泳。（一）紙電泳電泳時經(jīng)過膜的預處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點是分離速度快、電泳時間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。

06-03血清蛋白的電泳圖譜（二）醋酸纖維素薄膜電泳由區(qū)帶電泳中派生出一種用凝膠物質(zhì)作支持物進行電泳的方式，被稱為凝膠電泳。普通的凝膠電泳在板上進行，以凝膠作為介質(zhì)。電泳中常用的凝膠為葡聚糖、交聯(lián)聚丙烯酰胺和瓊脂糖。它具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品量小(1～100μg）、分辨率高等優(yōu)點。

06-04凝膠電泳圖（三）凝膠電泳毛細管電泳的基本工作原理：溶液中的帶電粒子以高壓電場為驅(qū)動力，沿毛細管通道，以不同速度向與其所帶電荷相反的電極方向遷移，并依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離。

毛細管區(qū)帶電泳是通過在充滿電解質(zhì)溶液的毛細管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場的作用下，依遷移速度的不同而進行分離的。根據(jù)組分的遷移時間進行定性，根據(jù)電泳峰的峰面積或峰高進行定量分析。（四）毛細管區(qū)帶電泳06-11毛細血管區(qū)帶電泳原理圖

1.高靈敏度2.高速度3.高分辨率4.樣品少5.自動化程度高6.應用范圍廣

06-10

英特雷勃——全自動電泳儀毛細管電泳的特點實例區(qū)帶電泳（CZE）分離硝基酚位置異構體1.

了解CZE分離的基本原理2.

了解電泳儀的基本構造；掌握其基本操作技術3.

運用CZE分離硝基苯酚異構體電泳分離分析裝置示意圖電泳裝置組成

高壓源系統(tǒng)：提供大小可變方向可控的直流電壓分離系統(tǒng)：提供樣品分離分析的通道和場所檢測記錄系統(tǒng)：實現(xiàn)對樣品的檢測與信號的記錄玻璃處理前：二氧化硅（SiO2)x石英玻璃毛細管內(nèi)表面結構常用毛細管為石英玻璃毛細管經(jīng)處理后石英玻璃毛細管內(nèi)表面結構水解處理pH>3Si-O-+H+Si-OH硅羥基的電離SiO-SiSiO-SiSiO-SiO-SiOOO-O-O-H＋H＋H＋H＋H＋H＋H＋毛細管內(nèi)液體當毛細管內(nèi)充滿水時，會出現(xiàn)雙電層：SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOOH＋H＋H＋Na+Na+Na+Na+毛細管內(nèi)液體當毛細管內(nèi)液體為pH7.0磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉緩沖液-電滲和電泳+電滲

電滲是一種液體相對于帶電管壁移動的現(xiàn)象。水合離子引起的流體整體移動。是毛細管內(nèi)液體及其中所有組分共有的現(xiàn)象，包括溶劑、各種溶質(zhì)（帶電離子與中性分子）電泳

電泳是帶電離子在電場作用下的定向移動。是毛細管內(nèi)帶電離子的特有現(xiàn)象，中性分子無電泳現(xiàn)象。SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO-Na+Cl-電滲電泳電泳遷移速度Na+Cl-矢量速度合速度+隨著遷移速度不同，逐漸形成樣品譜帶,依次在檢測窗口被檢測Na+Cl--+Na+Cl-Na+Cl--+毛細管電泳區(qū)帶電泳法分離硝基苯酚對硝基苯酚

7.15鄰硝基苯酚

7.22間硝基苯酚

8.39

pKa硝基苯酚的電離O-NO2OHNO2電離后，硝基苯酚負電荷含量硝基苯酚受電場作用力pKa

對<鄰<間Q對>鄰>間F對>鄰>間電泳速度對>鄰>間電滲速度不變合速度

對<鄰<間出峰順序：間、鄰、對2、等速電泳(ITP)等速現(xiàn)象：電泳靜態(tài)達到后，被分離的離子淌度按順序性梯形遞減。1964年，由于Everaerts和Martin的重要貢獻，ITP正式誕生。在研究中，他們發(fā)現(xiàn)在ITP達到靜態(tài)后，所有被分離的離子以相同的速度移動。因此，他們命名這一分離工具為iso-tach-phoresis(iso=equal=相等，tach=velocity=速度，phoresis=electrophoresis=電泳)。

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子（置于一端的電泳槽中），試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.

前導電解質(zhì)的遷移率高于任何樣品組分，后者則低于任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強電場的作用下，各被分離組分在前導電解質(zhì)與尾隨電解質(zhì)之間的空隙中移動，實現(xiàn)分離。等速電泳圖示3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(ν=mE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度小。

在等速電泳達到靜態(tài)后，所有的被分離的區(qū)帶以相同的速度向前移動，移動最快的離子為前導離子（leadingion），遷移最慢的離子為尾隨離子（terminatingion），其它遷移速度介于兩者之間的離子按速度大小依次分離。分離后的區(qū)帶為近矩形，不同離子的區(qū)帶與區(qū)帶之間為“肩并肩”的形式。在等速電泳中，區(qū)帶之間的界面是非常清晰的。這是由于存在“自校正效應”或“自銳利效應”。如果前導離子擴散進入鄰近的區(qū)帶，由于前導離子淌度高于鄰近的離子淌度，在鄰近區(qū)帶內(nèi)前導離子速度會高于鄰近離子速度，結果擴散進入鄰近區(qū)帶的前導離子重新遷移回自己的區(qū)帶。分析其它離子的擴散遷移會得到類似的結果。特點：界面明顯，富集、濃縮作用。等電聚焦電泳等電聚焦電泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）：利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質(zhì)）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內(nèi)制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負電荷），最后，樣品的各組分在各自的等電點聚焦成一條清晰而穩(wěn)定的窄帶。Pr為兩性電解質(zhì)，不同Pr的pI不同，pI范圍窄且凈電荷為零，因此依pI分離Pr。

EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成從陽極到陰極逐步增加的pH梯度(連續(xù)的,穩(wěn)定的,線性的pH)。當Pr在電場中遷移到它的PI時，由于凈電荷為零，不再移動。如擴散，附近的凝膠會使其荷電陽、陰極會重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。稱這種濃縮效應為聚焦。只要凝膠中的pH梯度范圍足夠窄。便可將pI相近的Pr分開，EF是電泳技術中分辨率最高的技術。原理關鍵：pH梯度的建立產(chǎn)生pH梯度的方法通常有兩種：一種是用兩種不同pH的緩沖液互相擴散，在混合區(qū)形成pH梯度，稱為人工pH梯度。但這種pH梯度不很穩(wěn)定，常用于制備電泳。另一種是利用兩性電解質(zhì)載體（Carrierampholytes）在電場的作用下自然形成pH梯度，稱為天然pH梯度。方法理想的載體兩性電解質(zhì)的合成用具有幾個pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）為原料，與不飽和酸（如丙烯酸）發(fā)生加合反應：加合反應優(yōu)先加在α、β不飽和酸的β碳原子上，調(diào)節(jié)胺和酸的比例可以加上一個或多個羧基，這種合成方法與一般有機會合成不同，有機合成一般要求合成的產(chǎn)物愈純愈好，而這里要求合成出的產(chǎn)物愈復雜愈好，要有多異構物和同系物，以保證的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，從而得到平滑的pH梯度。載體兩性電解質(zhì)的等電點在pH3-10的范圍，分子量在300-1000之間。等電聚焦電泳示意圖上圖左以A，B兩種蛋白質(zhì)為例，作出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷，在pH6.5時，A帶有兩個正電荷，B帶有一個負電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的「等電點」。

IEF是在具有pH梯度環(huán)境中進行的電泳。將蛋白質(zhì)置于不同pH梯度的膠體進行電泳，它會朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動，直到抵達等電點（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會因為帶電而再度移動到和它pI相符的pH處。優(yōu)點：①使用兩性載體電解質(zhì)，在電極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度；②由于“聚焦效應”，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區(qū)帶界面；③電泳速度快；④分辨率高;⑤加入樣品的位置可任意選擇；⑥可用于測定蛋白質(zhì)類物質(zhì)的等電點；⑦適用于中、大分子量（如蛋白質(zhì)、肽