實驗六-酵母蔗糖酶的提取及純化-生化實驗文檔資料文檔

第1頁，共6頁第1頁，共6頁實驗六酵母蔗糖酶的提取及純化原理蔗糖酶（invertase）（—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特異地催化非還原糖中的—呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，本實驗采用Nelson比色法測定還原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。＋＋H2O蔗糖酶OHHO在研究酶的性質、作用、反應動力學等問題時都需要使用高度純化的酶制劑以避免干擾。酶的提純工作往往要求多種分離方法交替應用，才能得到較為滿足的效果。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性變性、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等。酶蛋白在分離提純過程中易變性失活，為能獲得盡可能高的產率和純度，在提純操作中要始終注意保持酶的活性如在低溫下操作等，這樣才能收到較好的分離效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉淀，柱層析等步驟提取蔗糖酶，并對其性質進行測定。一、蔗糖酶的提取與部分純化（一）實驗目的學習酶的提取和純化方法，掌握各步驟的實驗原理，并為后續(xù)實驗提供一定量的蔗糖酶。（二）實驗原理（略）（三）實驗儀器、材料及試劑儀器高速冷凍離心機、恒溫水浴箱、－20℃冰箱電子天平、研缽（＞200ml）、制冰機、50ml燒杯離心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒材料及試劑市售鮮啤酒酵母（低溫保存）石英砂（海沙）、甲苯（使用前預冷到0℃以下）95%乙醇（預冷－20℃）、去離子水（使用前冷至4℃左右）Tris-HCl（pH7.3）緩沖液（四）操作步驟1.提取第2頁，共6頁第2頁，共6頁（1）將市售鮮啤酒酵母2000rpm，離心10min，除去大量水分。（2）將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。（3）稱取50g鮮啤酒酵母，加30g石英砂放入研缽中，加50ml預冷的甲苯（邊研邊加）或預冷的去離子水，在研缽內研磨成糊狀，然后每次緩慢加入預冷的10ml去離子水，邊加邊研磨以便將蔗糖酶充分轉入水相。共加75ml去離子水，研磨約40~60分鐘，使其成糊狀液體。（注：研磨時可用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎）。（4）將混合物轉入50ml（或分裝入2個30ml）離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機離心，4℃，15000rpm，15min。觀察結果：如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。（4）用移液器（或滴管）吸出上層有機相（棄掉）。（5）用移液器小心地取出脂肪層下面的水相液轉入量筒，量出體積，并記錄。（6）取出2ml放入2ml離心管中（標記為粗級分I，－20℃下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中。2.熱處理（1）將盛有粗級分I的小燒杯迅速地放入50℃恒溫水浴中，保持30分鐘，并用玻璃棒溫和攪動。（2）取出小燒杯，迅速用冰浴冷卻，轉入清潔的離心管中（根據量大小選擇離心管），4℃，15000rpm，離心15min。（3）將上清液轉入量筒，量出體積，并記錄。（4）取出2ml放入2ml離心管中（標記為熱級分II，－20℃下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中。3.乙醇沉淀（1）將盛有熱處理后的上清液放入小燒杯，在冰浴下逐滴加入預冷的等體積（逐滴加入）95%乙醇，溫和攪拌、放置，需1小時。（2）轉入清潔的離心管中，用4℃，15000rpm，離心15min，傾去上清，并滴干。（3）離心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）緩沖液充分溶解（若溶液混濁，則用離心管，4000rpm離心除去不溶物），轉入量筒，量出體積，并記錄。（4）取出2ml放入2ml離心管中（標記為醇級分Ⅲ，－20℃下保存），用于測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔的小燒杯中，用于下一步實驗。（注：離心管中沉淀也可蓋上蓋子或薄膜封口，然后將其放入冰箱中冷凍保存，用時再處理）（五）實驗結果與分析記錄實驗結果，并加以解釋，若有異?，F象出現，可進行分析討論。（六）注意事項二、蔗糖酶活性及蛋白質濃度的測定（一）實驗目的學會用考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度，用Nelson方法測定酶活力。掌握各步驟的實驗原理和方法。（二）實驗原理本實驗以Nelson方法測定酶活力，其原理是還原糖含有的自由醛基或酮基，在堿性溶液中將Cu2+還原成氧化亞銅，糖本身被氧化成羥酸，砷鉬酸試劑與氧化亞銅生成藍色溶液，在510nm下有正比于還原糖的吸收，從而可確定酶的活力，測定范圍：25~200μg。第3頁，共6頁第3頁，共6頁本實驗用考馬斯亮藍結合法測定蛋白濃度，考馬斯亮藍能與蛋白質的疏水微區(qū)相結合，這種結合具有高敏感性?？捡R斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當它與蛋白質結合形成復合物時呈藍色，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，考馬斯亮藍G250－蛋白質復合物的高消光效應導致了蛋白質定量測定的高敏感度。在一定范圍內，考馬斯亮藍G250－蛋白復合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質含量呈線性關系，故可以用于蛋白質濃度的測定。（三）實驗儀器、材料及試劑儀器1.722型（或7220型）分光光度計、電子分析天平、恒溫水浴箱2.量筒、容量瓶、移液器、試管。材料及試劑1.考馬斯亮藍(G250)染液（0.01%）：稱取0.1g考馬斯亮藍G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml濃磷酸（市售質量百分渡為85%），然后加蒸餾水定容至1000ml。2.0.9%NaCl溶液3.牛血清標準蛋白液（0.1mg/ml）：準確稱取牛血清蛋白0.1g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀釋至1000ml。4.4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。5.0.2mol/L乙酸緩沖溶液(pH4.5)：（1）0.2mol/LNaAC：稱取27.616gNaAC溶解并定容至1000ml。（2）0.2mol/LHAC：100ml乙酸(分析純)定容至500ml。（3）將兩者分別取315ml、185ml混合，用強堿調pH到4.5。6.Nelson試劑：A試劑：100ml溶劑中含Na2CO32.5g，NaHCO32.0g，酒石酸鉀鈉（酒石酸鈉）2.5g，Na2SO420g。B試劑：100ml溶劑中含CuSO4?5H2O15g，濃H2SO42滴。以A：B=50：2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶質析出。7.砷鉬酸試劑：100ml中含鉬酸銨5g，濃H2SO44.2ml，砷酸鈉0.6g。（砷酸鈉有毒，實驗中注意）（四）操作步驟1．各級分蛋白質濃度測定（1）蛋白質濃度測定――標準曲線的制備取7支干凈試管，按表1編號并加入試劑混勻。以吸光度平均值為縱坐標，各管蛋白含量作為橫坐標作圖得標準曲線。（或將數據代入線性回歸方程，求出Y？和r？）表1考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度――標準曲線的繪制編號0123456標準蛋白液/ml—0.10.20.30.40.50.60.9%NaCl/ml1.00.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍/ml4444444蛋白含量/μg0102030405060室溫靜置5min第4頁，共6頁第4頁，共6頁A595nm（2）各級分蛋白濃度的測定取9支干凈試管，每級分做兩管，按表2編號并加入試劑混勻。讀取吸光度值。以各級分的吸光度的平均值查標準曲線即可求出蛋白質含量。各級分應進行一定倍數的稀釋，先試做，選其吸光度值在標準曲線內，即蛋白含量應在10~80μg的稀釋度為宜。表2各級分蛋白濃度的測定編號1234粗級分I/ml熱級分II/ml醇級分III/ml柱級分IV/ml0.9%NaCl/ml考馬斯亮藍/ml44444444蛋白含量/μg各級分應進行一定倍數的稀釋，先試做，選其吸光度值在標準曲線內，即蛋白含量應在10~80μg的稀釋度為宜室溫靜置5minA595nmA595nm平均值各級分蛋白濃度mg/ml2．各級分蔗糖酶活性的測定（1）蔗糖酶活性的測定――標準曲線的制作取9支試管，按表3加樣。以吸光度值（O.D）為縱坐標，以還原糖（葡萄糖含量，μmol）作為橫坐標作圖得標準曲線。（或將數據代入線性回歸方程，求出Y？和r？）（2）各級分蔗糖酶活性測定取9支干凈試管，分兩組，按表4編號并加入試劑混勻。各級分酶液應進行一定倍數的稀釋，先試做，選其吸光度值在標準曲線內，即還原糖含量應在0.08~1.2μmol的稀釋度為宜。讀取吸光度值。以各級分的吸光度的平均值查標準曲線即可求出蛋白質含量。第5頁，共6頁第5頁，共6頁編號0123456784mmol/L葡萄糖/ml－0.020.050.100.150.200.250.30—4mmol/L蔗糖/ml－－－－－－－－0.2蒸餾水/ml10.980.950.900.850.800.750.700.80葡萄糖量/μmol00.080.20.40.60.811.2Nelson試劑向每管中加入1mlNelson試劑，蓋上塞子，置于沸水浴中20分鐘，再冷至室溫（在堿性條件下糖被氧化，將Cu2+還原成氧化亞銅（Cu20）砷鉬酸試劑向每個管中加入1ml砷鉬酸試劑，5分鐘（砷鉬酸試劑與氧化亞銅生成藍色溶液）蒸餾水/ml向每個管中加入7ml蒸餾水，充分混勻A510nm表3表3Nelson法測定蔗糖酶活性――標準曲線的繪制表4各級分蔗糖酶活性測定樣品空白粗級分I熱級分II醇級分III柱級分IV編號012121212乙酸緩沖液/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.2蒸餾水/ml0.60.5mol/L蔗糖/ml0.20.20.20.20.20.20.20.20.2各級分酶液/ml—？？？？？？？？室溫時間/min10分鐘Nelson試劑向每管中加入1mlNelson試劑，蓋上塞子，置于沸水浴中20分鐘后冷至室溫砷鉬酸試劑向每個管中加入1ml砷鉬酸試劑，5分鐘蒸餾水/ml向每個管中加入7ml蒸餾水，充分