VERO細胞培養(yǎng)課件

細胞培養(yǎng)1cellculture1精選2021版課件細胞培養(yǎng)技術從生物體內取出組織或細胞，在體外(invitro)模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，對這些組織或細胞進行孵育培養(yǎng)，使之保持一定的結構和功能，以便于我們觀察研究，這種方法就是細胞培養(yǎng)（cellculture）。有時細胞培養(yǎng)也稱為組織培養(yǎng)（tissueculture)。2精選2021版課件細胞培養(yǎng)目的和用途

1、科學研究

（1）藥物研究開發(fā)，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細胞工程、藥物研究與開發(fā)、單克隆抗體制備等（2）基礎研究，如藥物作用機理、基因功能、疾病發(fā)生機理等研究2、生物制藥（1）疫苗生產：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（腫瘤疫苗)等（2）基因工程藥物生產：如EPO等（3）抗體藥物、基因治療藥物生產（4）細胞工程藥物生產：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質等（5）利用細胞法體外測定生物活性物質的活性；并預測其在體內的藥效和替代體內法檢測其成品的生物活性3精選2021版課件主要內容基本概念準備工作培養(yǎng)用液基本技術污染及防治腫瘤細胞的培養(yǎng)參考資源4精選2021版課件基本概念5精選2021版課件初代培養(yǎng)（primaryculture）

又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物，一般持續(xù)1-4周。

一旦已進行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細胞系。傳代培養(yǎng)（subculture/passage）

細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中,一般情況下可傳代10-50次。也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。克?。╟lone）從一個細胞靠有絲分裂獲得的一個細胞群體（population）從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株（strain）再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，稱為亞株（Substrain）6精選2021版課件cellline:原代培養(yǎng)物經首次傳代成功后即成為細胞系。如果不斷繼續(xù)傳代或傳代數有限，可稱為有限細胞系（finitecellline）如果可以連續(xù)傳代，則可稱為連續(xù)細胞系（continouscellline）或無限細胞系（InfiniteCellLine）有惡性的無限細胞系：“惡性轉化細胞系”只具永生性而無惡性的細胞系：無限細胞系或轉化細胞系:NIH3T3、Rat-1細胞系7精選2021版課件細胞株cellstrain:由原代培養(yǎng)中，用選擇或克隆，選出具有特征標記的細胞，經傳代形成細胞株。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數有限，稱為有限細胞株（finitecellstrain）如果可以連續(xù)傳代，稱為連續(xù)細胞株（continuouscellstrain）。8精選2021版課件細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期反應細胞增殖速度9精選2021版課件體外培養(yǎng)細胞的種類和命名

腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，多采用有一定意義縮寫字或代號表示幾種代表性的細胞名稱：

HeLa：供體患者的姓名（來源于宮頸癌）

CHO：中國地鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary）

宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立

NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究所（NationalInstituteofHealth）建立；每3天傳代，每次接種3×105細胞／ml

10精選2021版課件建立細胞系（或株）的要求原代培養(yǎng)的細胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可傳代的細胞，需做如下說明：1、組織來源：細胞供體所屬物種，來自人體或者動物；個體性別、年齡；取材的器官或組織。如系腫瘤組織，應說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。2、細胞生物學檢測：了解細胞一般和特殊的生物學性狀，如細胞一般形態(tài)，特異結構，細胞生長曲線和分裂指數，倍增時間，接種率等。如為腫瘤細胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。3、培養(yǎng)條件和方法：

應說明細胞系（或株）適應的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。

11精選2021版課件國內外相關細胞庫

國內細胞庫

武漢細胞庫

/fzlbc/cell.doc

上海細胞庫

/xibao/catalogue.html

昆明細胞庫

/CELL.HTM

成都基因治療腫瘤藥物工程技術研究中心細胞及載體服務

/cell_catalog.asp

南京中醫(yī)藥大學新藥及海洋藥物研究中心藥理毒理研究室細胞庫目錄

/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm

湖南遠泰生物技術有限公司生物資源庫

/Source.asp

上海午立生物技術有限公司細胞株

/cpjs-4.htm

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心保藏細胞目錄

/cellhouse.doc

上海華大天源生物科技有限公司提供高表達GPCR細胞株和報告基因分析細胞系：

/03chanpin.htm

中國工業(yè)微生物菌種保藏中心

/inl%20col/introduction.htm

臺灣快興科技股份有限公司Cambrex產品

.tw/Cambrex.htm

臺灣國家衛(wèi)生研究院

.tw/index/home2.htm

美國和歐洲細胞庫

ATCC（細胞株及胚胎干細胞庫）

1）下載細胞庫目錄：/pdf/tcl.pdf2）查詢細胞株：/SearchCatalogs/CellBiology.cfm3）胚胎干細胞庫：/products/cells.cfm

CABRI(包括ECACC、DSMZ)

/HyperCat/cells/all.htm

CAMBREX

/Content/General/CatalogMap.asp

意大利I.A.Z.

http://www.i-a-z-zellkultur.de/haupt_en/cell.html

歐洲細胞實驗室列表（大全）

http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html

意大利IZSLER細胞庫

http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/

ABi病毒

/products/viruses/default.htm

德國PromoCell原代細胞

/en/Navigate/product0.php3?target1=11lang=US

12精選2021版課件細胞庫ATCC:AmericanTypeCultureCollection(美國標準培養(yǎng)物收集所)ECACC:EuropeanCollectionofCellCultures(歐洲動物細胞庫)JCRB:JapaneseCollectionofResearchBioresources(日本細胞庫)CCTCC:ChinaCenterforTypeCultureCollection(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)13精選2021版課件ATCCWHO的國際培養(yǎng)細胞文獻中心ATCC液氮凍存有3200個已經過鑒定的細胞系來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株ATCC接納入庫細胞時，必須符合其入庫標準，檢測項目如下：培養(yǎng)簡歷凍存液細胞活力培養(yǎng)液細胞形態(tài)核型無污染檢測物種檢測免疫檢測細胞建立者14精選2021版課件培養(yǎng)細胞的類型及其特點

培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞。懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下生長，不需要貼附于支持物表面。包括一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細胞，尤其是血液白細胞，以及一些腫瘤細胞，如白血病細胞。15精選2021版課件16精選2021版課件17精選2021版課件

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）18精選2021版課件細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)此時細胞回縮，胞體呈圓球形10分鐘～4小時游離期（懸浮期）19精選2021版課件細胞附著于底物上，游離期結束。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的糖蛋白（生長基質），這些促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。貼壁期20精選2021版課件21精選2021版課件22精選2021版課件此時細胞有生長活動，而無細胞分裂潛伏期：6～24小時潛伏期23精選2021版課件細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究對數生長期24精選2021版課件細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制（ContactInhibition）。當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導致細胞分裂停止

腫瘤細胞的接觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細胞可向三維空間發(fā)展，導致細胞堆積，并可生長至較高的終末細胞密度?？勺鳛閰^(qū)別正常與癌細胞標志之一。平臺期25精選2021版課件26精選2021版課件1、無污染環(huán)境：保證細胞生存的首要條件

2、恒定的溫度：36.5℃±0.5℃

3、氣體環(huán)境：95%空氣，5%二氧化碳混合氣體4、細胞培養(yǎng)基：基礎物質、生存環(huán)境(pH7.2-7.4、滲透壓)

培養(yǎng)細胞生存條件27精選2021版課件培養(yǎng)細胞的生存條件培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶

溫度、濕度和氣體由CO2恒溫孵育箱提供

生長培養(yǎng)液10～20％血清

維持培養(yǎng)液2～5％血清

營養(yǎng)物質糖、氨基酸、維生素、無機離子、微量元素等

28精選2021版課件實驗準備實驗室設備器材實驗器材處理細胞培養(yǎng)用液的配制29精選2021版課件實驗室設計準備室（包括配液室）無菌室：緩沖間、操作間30精選2021版課件設備器材大型工具類超凈工作臺CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐酶標儀、微孔板震蕩器消毒滅菌類紫外燈、壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸配液用具自動雙重純水蒸餾器，純水儀制備細胞用品耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，培養(yǎng)板，凍存管31精選2021版課件準備室的設備：蒸餾器酸缸烤箱高壓鍋儲品柜（放未消毒物品）儲品柜（放消毒過的物品）包裝臺配液室的設備：扭力天平和電子天平PH計磁力攪拌器32精選2021版課件培養(yǎng)室的設備：液氮罐低溫冰箱（-80℃）CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）二氧化碳缸瓶4℃冰箱（放serum和培養(yǎng)用液）日光燈和紫外燈儲品柜（存放雜物）水浴鍋邊臺（書寫實驗記錄）空氣凈化器系統(tǒng)三氧消毒殺菌機空調必須放在無菌間的設備：離心機超凈工作臺倒置顯微鏡33精選2021版課件壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：用干玻璃器皿消毒（160℃，2h）濾器：過濾法除菌：大多數培養(yǎng)用液(人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等)超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

34精選2021版課件超凈工作臺工作原理利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。35精選2021版課件濾器36精選2021版課件CO2培養(yǎng)箱設定條件為37℃，5％CO2

使用時應注意：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒③箱內滅菌蒸餾水3L蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)37精選2021版課件數碼型倒置熒光顯微鏡CFM-550Z

38精選2021版課件自動雙重純水蒸餾器純水儀39精選2021版課件酶標儀微孔板震蕩器40精選2021版課件培養(yǎng)板41精選2021版課件培養(yǎng)瓶42精選2021版課件器械的清洗和消毒

43精選2021版課件實驗器材處理刷洗→包裝→消毒滅菌消毒和滅菌

干烤160℃，120分鐘

過濾除菌微孔薄膜過濾

高壓蒸汽滅菌濕熱滅菌

紫外線消毒電磁輻射

蒸汽消毒乳酸、甲醛熏蒸

化學消毒劑0.1％新潔而滅

44精選2021版課件玻璃器械洗消浸泡、刷洗、浸酸、和清洗一、舊的玻璃器皿的洗消1、刷洗、烘干2、泡酸、清洗3、烘干、包裝4、高壓消毒5、烘干備用45精選2021版課件玻璃器械洗消二、新的玻璃器皿的洗消1、自來水刷洗2、烘干、泡鹽酸3、刷洗、烘干4、泡酸、清洗5、烘干、包裝6、高壓消毒7、烘干備用46精選2021版課件金屬器械洗消不能泡酸洗滌劑刷洗自來水沖凈75％酒精擦拭自來水、蒸餾水沖洗晾干高壓烘干備用47精選2021版課件橡膠和塑料制品洗消洗滌劑洗刷

用自來水和蒸餾水沖凈

烤箱烘干新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH煮沸30分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

塑料制品特點：質軟、易出現劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。

1、針式濾器帽不能泡酸液,用2％氫氧化鈉泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒，再烘干備用。2、膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入稀鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。3、膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入稀鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用4、膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。5、其他消毒方法：可用70％酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。48精選2021版課件注意事項：1、嚴格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：水：防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸2、安裝濾膜時注意光面朝上：否則起不到過濾的作用3、注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底49精選2021版課件甲醛薰蒸：40％甲醛溶液，15-30ml／m3，室溫21～24℃，相對濕度75％～85％每個房間是7個平方，約20個立方。要甲醛300-600ml，高錳酸鉀100-200g高錳酸鉀放入甲醛液體中后，在開始的3秒鐘內沒有反映，3秒鐘以后，會產生大量煙氣。所以一旦在甲醛中加了高錳酸鉀請馬上離開滅菌室，并關上門。高錳酸鉀放入甲醛液體中會使液體沸騰，所以反應要在比較大的大口徑容器進行。甲醛氣體毒性非常強，所以操作時一定要帶上防毒面具。50精選2021版課件細胞培養(yǎng)用液51精選2021版課件細胞培養(yǎng)用液水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液消化液：胰蛋白酶pH調整液抗生素培養(yǎng)液52精選2021版課件平衡鹽溶液（BSS）53精選2021版課件54精選2021版課件55精選2021版課件作用----使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用（血清中含有抗蛋白酶成分）消化液：胰蛋白酶56精選2021版課件pH調整液1、NaHCO3溶液2、HEPES液是一種弱酸—羥乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPES對細胞無毒性，可防止pH值迅速變動57精選2021版課件培養(yǎng)基（1）合成培養(yǎng)基：是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖（2）天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質與合成培養(yǎng)基合用，能使細胞順利增殖生長常見使用最為5-20%58精選2021版課件天然培養(yǎng)基：指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限、成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析、易發(fā)生支原體污染

59精選2021版課件合成培養(yǎng)基:

是根據天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。

主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽等在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源

優(yōu)點：標準化生產，組分和含量相對固定、成本低缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）

60精選2021版課件血清中含有：①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分支持細胞生長需加10％血清61精選2021版課件

血清質量好壞是實驗成敗的關鍵

常用血清有胎牛、新生牛、小牛、兔、馬血清等優(yōu)質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌62精選2021版課件無血清培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。

目前，絕大多數人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清63精選2021版課件常用細胞培養(yǎng)基

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