病毒總論重點(diǎn)

朽木易折，金石可鏤。千里之行，始于足下。第頁(yè)/共頁(yè)病毒的5大特點(diǎn)形體極小，缺乏細(xì)胞結(jié)構(gòu)只含有一種核酸，DNA或RNA以自身的核酸為模板舉行復(fù)制缺乏殘破的酶和能量系統(tǒng)鄭重的細(xì)胞內(nèi)寄生病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成一、病毒的結(jié)構(gòu)病毒粒子：成熟的、結(jié)構(gòu)殘破、具有侵染力的單個(gè)病毒，又稱病毒顆粒。一個(gè)結(jié)構(gòu)上殘破的病毒顆粒，主要由兩部分組成：中央為核酸基因組，外部包裹一層蛋白質(zhì)組成的外殼，即衣殼。核衣殼：衣殼及其包裹的核酸基因組（芯髓）的合稱。殼粒：由一定數(shù)量的蛋白亞基以異常的方式聚攏形成在電子顯微鏡下可見的形態(tài)單位衣殼的功能1.保護(hù)核酸，免受核酸酶或其他影響因素的破壞2.與宿主細(xì)胞受體結(jié)合并促使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞3.良好的抗原病毒的對(duì)稱性按照殼粒數(shù)目和羅列不同,三類典型形態(tài)的病毒：螺旋對(duì)稱動(dòng)物病毒中螺旋對(duì)稱的病毒均屬有囊膜的單股RNA病毒二十面體對(duì)稱有20個(gè)等邊三角形構(gòu)成12個(gè)頂、20個(gè)面、30個(gè)棱的立體結(jié)構(gòu)。除痘病毒外，所有脊椎動(dòng)物DNA病毒均為二十面體復(fù)合對(duì)稱痘病毒和噬菌體，看不到單純的正二十面體對(duì)稱和螺旋樣對(duì)稱囊膜(envelope)：有的病毒在核衣殼外包裹著一層薄膜，為雙層脂質(zhì)膜，由脂類蛋白和寡聚糖組成纖突(spike)或膜粒:病毒表面的糖蛋白突起物囊膜和纖突構(gòu)成病毒的表面抗原，與病毒的宿主細(xì)胞嗜性、致病性以及免疫原性有密切關(guān)系。有囊膜的病毒稱囊膜病毒，無(wú)囊膜的稱裸露病毒。纖突可介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合（吸附），刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。亞病毒：朊病毒：致病性蛋白質(zhì)顆粒（Prion）。沒有核酸，只含有蛋白成分，是牛海綿狀腦病、綿羊癢病病原類病毒：侵染性核糖核酸（RNA），只含有核酸，沒有蛋白，主要侵犯植物假病毒：衣殼包裹宿主細(xì)胞的核酸三、病毒的化學(xué)組成1.核酸DNA病毒多數(shù)為雙股、線狀RNA病毒多數(shù)為單股線狀，不分節(jié)段正股：病毒核酸與mRNA的堿基序列相同。負(fù)股：病毒核酸與mRNA的堿基序列互補(bǔ)。感染性核酸：病毒在去除其囊膜和衣殼后，裸露的DNA或RNA仍能感染細(xì)胞，這樣的核酸成為感染性核酸。普通不分節(jié)段。其本身能作為mRNA或能利用宿主細(xì)胞的酶轉(zhuǎn)錄生成mRNA。2.蛋白質(zhì)所有衣殼蛋白和囊膜的主要成分。結(jié)構(gòu)蛋白：組成病毒體的蛋白成分。包括：衣殼蛋白、囊膜蛋白或纖突蛋白等非結(jié)構(gòu)蛋白：在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的某些中間產(chǎn)物，參加病毒的復(fù)制和組裝過程，并不一定存在于成熟的病毒粒子中。具有酶的活性或其他功能3.脂質(zhì)主要存在于囊膜中，主要來(lái)源于宿主細(xì)胞膜系統(tǒng)。含脂質(zhì)的病毒對(duì)乙醚或其它有機(jī)溶劑敏感，處理后可使病毒失去感染性或感染性降低，而無(wú)囊膜病毒對(duì)乙醚有抵御力。4.糖類以糖蛋白形式存在(纖突)，由病毒的基因組編碼。病毒的復(fù)制復(fù)制：病毒以其基因組為模板，借助于DNA或RNA聚合酶，分離合成其基因及蛋白質(zhì)，再組裝成殘破的病毒顆粒。感染比（MOI)：指一個(gè)系統(tǒng)中感染病毒的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比。是用來(lái)表示病毒滴度的一個(gè)指標(biāo)。接種高M(jìn)OI的病毒，使所有細(xì)胞幾乎同時(shí)受到病毒感染。可獲得病毒的一步生長(zhǎng)曲線。病毒的復(fù)制周期：從病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞開始，經(jīng)過基因組的復(fù)制，最后釋放出來(lái)，稱為一個(gè)復(fù)制周期。主要包括吸附、穿入和脫殼、生物合成、組裝和釋放四個(gè)延續(xù)的步驟。吸附第一階段：病毒與細(xì)胞接觸，靜電結(jié)合（非特異性、可逆）第二階段（真正的吸附）：病毒表面位點(diǎn)與宿主細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合。與異常受體的結(jié)合是病毒特異性的，是限制病毒感染的關(guān)鍵步驟。病毒受體：宿主細(xì)胞表面的異常結(jié)構(gòu)，多為糖蛋白，有的為糖脂。穿入和脫殼病毒吸附宿主細(xì)胞膜上后，可通過多種穿入方式進(jìn)入細(xì)胞：①內(nèi)吞小體脫殼(病毒胞飲)②囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，病毒核衣殼直接進(jìn)入細(xì)胞漿③核膜脫殼④細(xì)胞表面酶類協(xié)助病毒脫殼生物合成在病毒感染細(xì)胞后的一個(gè)短時(shí)光內(nèi)，病毒粒子徹低出現(xiàn)，甚至在細(xì)胞內(nèi)也找不到傳染性的病毒顆粒，直至數(shù)小時(shí)后子代病毒粒子浮上為止，這段時(shí)期稱為蘊(yùn)藏期。是病毒增殖過程中最主要的階段。此期在病毒基因指令下，利用細(xì)胞的場(chǎng)所和原材料舉行生物合成。包括病毒核酸的復(fù)制和病毒蛋白質(zhì)的合成。①mRNA轉(zhuǎn)錄：是蛋白質(zhì)合成的第一個(gè)主要步驟。需要各種聚合酶（自身編碼或細(xì)胞內(nèi)）②mRNA翻譯：譯制出具有病毒信息的酶以及其他早期蛋白質(zhì)(用于抑制細(xì)胞的正常生物合成)。③病毒核酸的復(fù)制④mRNA再度轉(zhuǎn)錄⑤mRNA再度翻譯：合成晚期蛋白，包括病毒衣殼蛋白以及其他結(jié)構(gòu)蛋白。組裝和釋放核酸進(jìn)一步被修飾，病毒蛋白亞單位以最佳物理方式形成衣殼。組裝：病毒核酸進(jìn)入衣殼形成殘破的病毒粒子。釋放：無(wú)囊膜病毒通過極迅速度合成造成病毒粒子在胞漿中大量積聚，使細(xì)胞脹破釋放出病毒。有囊膜病毒釋放過程就是病毒核衣殼獲得囊膜的過程。病毒的遺傳和進(jìn)化一、突變是病毒核酸復(fù)制過程中不可避免的錯(cuò)誤。致命,不再具有存活和復(fù)制的能力—致死性突變適應(yīng)環(huán)境挑選（極少數(shù)）—非致死性突變基因組變異替換：?jiǎn)蝹€(gè)核苷酸，點(diǎn)突變。缺失或插入：小段或大段核苷酸。點(diǎn)突變發(fā)生的機(jī)率最大，小片段核苷酸缺失或插入次之,大片段核苷酸缺失發(fā)生的很少。突變的核苷酸有可能發(fā)生回復(fù)突變或抑制性突變。缺損型干擾(DI)突變株：大多數(shù)病毒能產(chǎn)生DI突變株,這些突變株自身不能復(fù)制，惟獨(dú)在親本野生株作為輔助病毒存在時(shí)才干復(fù)制，但它又會(huì)干擾親本病毒的復(fù)制，導(dǎo)致后者數(shù)量減少。表型變異表現(xiàn)為病毒顆粒的理化特性和復(fù)制性質(zhì)的改變。準(zhǔn)種：指由一種母序列和來(lái)自該序列的大量相關(guān)突變基因組所組成的病毒群體。是對(duì)病毒“種”概念的補(bǔ)充。充足體現(xiàn)了病毒的動(dòng)態(tài)進(jìn)化過程。二、基因重組兩種不同的病毒或同一種病毒的兩個(gè)不同毒株同時(shí)感染同一細(xì)胞時(shí),在核酸復(fù)制過程中發(fā)生的核酸水平的互換。包括重組、重配或復(fù)活。1.重組：將兩個(gè)有親緣關(guān)系但生物學(xué)性狀不同的毒株感染同一個(gè)宿主細(xì)胞，可發(fā)生核酸水平上的互換，產(chǎn)生兼有兩個(gè)親本特性的子代。2.重配：發(fā)生在基因組分節(jié)段的RNA病毒，病毒的兩個(gè)毒株在同時(shí)感染某一個(gè)細(xì)胞時(shí)，通過交換RNA節(jié)段而舉行的重組，或稱重排。3.復(fù)活：又稱增殖性復(fù)活，指用同一株病毒產(chǎn)生不同程度致死性突變的若干病毒顆粒同時(shí)感染某一細(xì)胞時(shí)，病毒重新具有傳染性。三、病毒基因產(chǎn)物間的互相作用補(bǔ)償作用：在感染的細(xì)胞中,病毒蛋白質(zhì)之間因?yàn)榛ハ嘧饔玫慕Y(jié)果，拯救了一種或兩種病毒或增強(qiáng)了病毒的產(chǎn)量。表型混合：兩種病毒混合感染細(xì)胞后，子代病毒獲得二者表型特性。四、誘變定點(diǎn)誘變：分子雜交技術(shù)、PCR、核苷酸測(cè)序技術(shù)病毒與細(xì)胞的互相作用一、病毒的細(xì)胞培養(yǎng)(病毒增殖的主意)動(dòng)物接種優(yōu)點(diǎn)：操作容易缺點(diǎn)：動(dòng)物體內(nèi)存在特異性抗體，動(dòng)物體內(nèi)帶有病毒雞胚培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便，雞胚易得缺點(diǎn)：有些雞胚帶有母源抗體，可能帶有病毒，無(wú)數(shù)病毒在雞胚中不生長(zhǎng)組織培養(yǎng)將離體的活組織塊或凝聚的活細(xì)胞加以培養(yǎng)，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)，后者又稱單層細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞的生理特性基本一致，對(duì)病毒的易感性相等。沒有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，不涉及動(dòng)物保護(hù)問題，實(shí)驗(yàn)數(shù)量有保障，可舉行標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，可重復(fù)性好。①原代細(xì)胞：用胰酶等凝聚劑將動(dòng)物組織消化成單個(gè)的細(xì)胞懸液，再生長(zhǎng)于培養(yǎng)器皿中。腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞最常用，分離病毒最為敏感。②二倍體細(xì)胞：將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化凝聚成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。③傳代細(xì)胞系：能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞系，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而來(lái)，可無(wú)限增殖。三、細(xì)胞內(nèi)病毒增殖的鑒定1.細(xì)胞變化：①細(xì)胞病變（CPE）：由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。常見的細(xì)胞變化為細(xì)胞圓縮、壞死、崩解或脫落。有些病毒能形成包容體。②包容體：是細(xì)胞在感染病毒后，浮上于胞漿和胞核內(nèi)的特征性形態(tài)變化?？赏ㄟ^固定、染色，在顯微鏡下檢測(cè)到。③合胞體：是病毒感染細(xì)胞后導(dǎo)致感染細(xì)胞及相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜融合的產(chǎn)物，表現(xiàn)為若干細(xì)胞的相鄰細(xì)胞膜出現(xiàn)，成為多核巨細(xì)胞。④細(xì)胞凋亡：病毒感染造成的細(xì)胞程序性死亡。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化；細(xì)胞DNA被降解形成梯帶，是宿主細(xì)胞重要的防御機(jī)制。2.血吸附作用：是一種異常形式的血凝作用，是將紅細(xì)胞吸附于病毒感染的宿主細(xì)胞表面，用于病毒檢測(cè)。3.細(xì)胞代謝的改變4.病毒的干擾現(xiàn)象：兩種不同種類的病毒同時(shí)接種于一個(gè)培養(yǎng)容器時(shí)，一種病毒的增殖對(duì)另一種病毒的增殖展示顯然的抑制作用。5.熒光抗體法（酶標(biāo)記抗體法）病毒感染細(xì)胞一定時(shí)光后，向細(xì)胞參加特異性的病毒抗體，再參加特異性的熒光標(biāo)記二抗，在熒光顯微鏡下看見。有特異性的黃綠色熒光浮上的為陽(yáng)性，否則呈紅色。6.中和實(shí)驗(yàn)特異性抗體能夠抑制病毒感染或降低病毒在細(xì)胞上的滴度。四、病毒數(shù)量與感染力的測(cè)定1.蝕斑：又稱空斑，是病毒在已長(zhǎng)成單層的細(xì)胞上形成的局限性病灶。一個(gè)蝕斑由一個(gè)以上感染性病毒體復(fù)制形成，類似于細(xì)菌的菌落。蝕斑測(cè)定：將10倍梯度稀釋的病毒懸液參加單層細(xì)胞中培養(yǎng)，病毒吸附細(xì)胞后，再籠罩一層融化的0.5%瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，逐漸擴(kuò)大，肉眼可見。蝕斑形成單位（PFU）:表示病毒懸液中的感染性病毒濃度，通常以每毫升病毒懸液中含有多少個(gè)PFU表示。2.ID50半數(shù)感染量TCID50半數(shù)細(xì)胞感染量EID50半數(shù)雞胚感染量病毒感染雞胚、動(dòng)物或細(xì)胞后，引起50％發(fā)生病變的病毒最小量。半數(shù)動(dòng)物致死量（LD50）：病毒感染動(dòng)物后，引起半數(shù)動(dòng)物死亡的病毒最小量。病毒載量：動(dòng)物血液中的病毒數(shù)量。RNA干擾：細(xì)胞利用內(nèi)源或外源性的小分子雙股RNA片段，特異性的降解同源基因的mRNA，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。用于抗病毒感染研究。病毒干擾：缺陷型病毒(DI)突變株和干擾素干擾素：屬于正常細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白即細(xì)胞因子。是細(xì)胞對(duì)強(qiáng)烈刺激時(shí)的一過性分泌物，不是細(xì)胞持續(xù)合成的。病毒的致病機(jī)理一、病毒對(duì)細(xì)胞的傷害1.細(xì)胞自身蛋白質(zhì)和核酸代謝發(fā)生障礙，及病毒粒子的堆積，造成細(xì)胞死亡2.病毒物質(zhì)的直接毒性作用。3.細(xì)胞性繼發(fā)作用，細(xì)胞自身的酶性活動(dòng)（溶酶體）。4.核型紊亂。5.有些病毒可直接溶解動(dòng)物紅細(xì)胞。6.細(xì)胞自身抗原成分發(fā)生變化。（自身免疫?。┏掷m(xù)性感染：病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，達(dá)數(shù)月或終生。無(wú)論發(fā)病或不發(fā)病，感染后會(huì)持續(xù)排毒。可能很遲才發(fā)生免疫病理病或腫瘤病。預(yù)后大多不良。宿主范圍窄，有遺傳傾向?？煞譃椋郝穹腥荆翰《净蚪M存在于一定的組織或細(xì)胞中，不產(chǎn)生有感染性的病毒體，在一定條件下可被激活而急性發(fā)作。急性發(fā)作期可以檢測(cè)到病毒的存在。慢性感染：顯性或急性感染后，病毒未徹低清除，可持續(xù)存在于血液和組織中，并不斷排出體外，感染全過程可檢出或分離到病毒。遲發(fā)性臨床癥狀的急性感染：此類病毒的持續(xù)性復(fù)制與疾病的進(jìn)程無(wú)關(guān)，如貓全白細(xì)胞減少癥病毒。分子模擬：指宿主細(xì)胞成分與病毒蛋白質(zhì)之間存在分子結(jié)構(gòu)的線性或構(gòu)象同源性。若病毒及宿主的抗原決定簇既相似又不相同,即二者的相似程度足以引起交錯(cuò)反應(yīng),但差異程度又能突破正常的免疫耐受,這樣的分子模擬就會(huì)導(dǎo)致自身免疫病。病毒的檢測(cè)一、病毒的分離和鑒定1.標(biāo)本的采集和運(yùn)送要分離到病毒，首先要采集含有充足量活病毒的標(biāo)本。必須注重采集部位、時(shí)光及運(yùn)送過程。①標(biāo)本采集部位：按照臨床癥狀、流行病學(xué)舉行分析，初步判斷可能是哪一種病，再?zèng)Q定采集何種標(biāo)本。采集到的標(biāo)本應(yīng)趕緊浸泡于生理鹽水、PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液中。②標(biāo)本采集時(shí)光：普通越早越好。晚期可能發(fā)生繼發(fā)感染，或體內(nèi)產(chǎn)生抗體。③標(biāo)本的運(yùn)送：需低溫保存，要避免反復(fù)凍融。2.標(biāo)本的處理將組織標(biāo)本中的病毒游離出來(lái)和除菌。①研磨與稀釋②除菌處理：采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)盡可能無(wú)菌操作，有細(xì)菌污染時(shí)必須除菌，可用抗生素(青霉素鏈霉素)處理。3.標(biāo)本的接種途徑按照病毒的嗜性挑選接種的動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞。4.病毒增殖的判斷①細(xì)胞病變②病毒間的干擾現(xiàn)象③細(xì)胞代謝④血細(xì)胞吸附⑤免疫熒光實(shí)驗(yàn)5.新分離病毒理化性質(zhì)的測(cè)定①病毒核酸型鑒定②脂溶劑敏感性實(shí)驗(yàn)(乙醚)③耐酸性實(shí)驗(yàn)④胰蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)⑤耐熱性實(shí)驗(yàn)二、血清學(xué)檢測(cè)或鑒定1.用已知抗病毒血清檢測(cè)未知病毒抗原將分離到的病毒與已知病毒的標(biāo)準(zhǔn)血清作中和實(shí)驗(yàn),補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、HI實(shí)驗(yàn)。2.用已知病毒抗原檢測(cè)血清中相應(yīng)抗體將分離到的病毒注射動(dòng)物，制備高免血清與標(biāo)準(zhǔn)病毒作中和實(shí)驗(yàn)。交錯(cuò)保護(hù)實(shí)驗(yàn)：用分離到的病毒和已知標(biāo)準(zhǔn)病毒分離感染動(dòng)物，留一組健康動(dòng)物作對(duì)照，經(jīng)一段時(shí)光后，用標(biāo)準(zhǔn)病毒襲擊，看見保護(hù)效果。三、病毒顆粒檢測(cè)1.電子顯微鏡可直接看見病毒形態(tài)。2.HA3.病毒酶活性測(cè)定4.綠色熒光蛋白標(biāo)記四、病毒滴度測(cè)定(病毒感染單位)蝕斑實(shí)驗(yàn)PFU、盡頭稀釋法（LD50等）、熒光-斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、MOI五、病毒核酸檢測(cè)分子生物學(xué)技術(shù)：基因組電泳分析、核酸雜交、PCR、酶切圖