實(shí)驗(yàn) 五 蛋白質(zhì)純化-鹽析沉淀法

實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)純化--鹽析沉淀法一實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當(dāng)鹽的濃度繼續(xù)增高時，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間存在靜電力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間的靜電力受鹽離子的影響而被消除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團(tuán)的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。一實(shí)驗(yàn)原理

鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25%飽和度的硫酸銨）使部分雜質(zhì)呈“鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來，經(jīng)離心法去除。而目的蛋白質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如25-60%飽和度的NH4SO4）使目的蛋白質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來。大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-6p細(xì)胞裂解液，由上一實(shí)驗(yàn)提供分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成細(xì)粉末。30%三氯乙酸,SDS所需試劑二

實(shí)驗(yàn)試劑

1鹽析曲線的測定對于一求知鹽析特性的蛋白質(zhì)來說，用鹽析作為一純化步驟時，應(yīng)首先用實(shí)驗(yàn)確定使此種蛋白質(zhì)鹽析沉淀出來的最佳飽和度，其測定方法如下：

（1）取7支微量離心管，用記號筆在管帽上標(biāo)記20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；（2）以上述離心管作容器分別稱取磨細(xì)的硫酸銨晶體末0.057克、0.088克、0.122克、0.156克、0159克、0.235克和0.281克；三操作步驟

（3）分別向上述裝有（NH4）2SO4粉末的離心管中添加0.5ml細(xì)胞裂解液，充分振蕩使（NH4）2SO4溶解后，在室溫下靜置2小時；（4）將離心管放置于離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心5分鐘后，傾去上清，倒立離心管，以便盡可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水及8μl30%三氯乙酸混勻,靜置10分鐘后,離心,盡量去除上清；(因此步會造成蛋白質(zhì)不溶影響后續(xù)工作，所以省略)

三操作步驟

（6）將離心管置于快速干燥器中干燥30分鐘；（7）向離心管中添加100μISDS上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分鐘，取出置-20℃冰箱中備用；（8）制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠；按下列上樣順序向加樣孔中添加10μl樣品：樣孔12345678910包涵體樣20%30%40%50%60%70%80%包涵體空白對照電泳分離后，染色、脫色、觀察目的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在何種濃度的（NH4）2SO4鹽析樣孔中，以確定最佳的鹽析條件。

三操作步驟

2鹽析（1）將50ml細(xì)胞裂解液置于100ml燒杯中，加入攪拌磁棒后放置在磁力攪拌器上（2）在攪拌狀態(tài)下緩緩加入研細(xì)的（NH4）2SO4末至最佳飽和度之前的一級飽和度，靜置2小時后,離心得上清（3）在攪拌下向上清中添加研細(xì)的（NH4）2SO4粉末，使終濃度達(dá)最佳飽和度，靜置2小時后離心收集目的蛋白沉淀（4）將沉淀的蛋白質(zhì)溶解于盡量小體積的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，用Bradford試劑測定蛋白質(zhì)濃度后，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

三操作步驟

1.為提高蛋白質(zhì)鹽析分離效率，應(yīng)采取哪些措施？2.為測定用硫酸銨鹽析法分離某種蛋白質(zhì)的最佳硫酸銨濃度，除采用本講義設(shè)計(jì)的操作程序