DB13-T1384-7-2011飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的測(cè)定

ICS65.120

B46

DB13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T1384.7—2011

飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾

氟沙星的測(cè)定

Determinationofenrofloxacin/ciprofloxacin/norfloxacininfeed

DB13/T1384.7—2011

飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中恩諾沙星，環(huán)丙沙星，諾氟沙星的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料中恩諾沙星，環(huán)丙沙星，諾氟沙星的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限為10.0μg/kg。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法（GB/T6682－2008，ISO3696:1987,MOD）。

3方法提要

試樣加入內(nèi)標(biāo)后，氫氧化鈉溶液提取，離子化的喹諾酮類(lèi)藥物經(jīng)過(guò)陰離子交換固相萃取柱富集凈化，

用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定，梯度洗脫，內(nèi)標(biāo)法定量。

4試劑與材料

除特別注明外，均為分析純?cè)噭凰疄榉螱B/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1甲醇：HPLC級(jí)。

4.2氫氧化鈉。

4.3甲酸（85％）。

4.4陰離子交換柱（PAX）：60mg，3mL，或相當(dāng)者。

4.5同位素內(nèi)標(biāo)：氘代諾氟沙星，純度≥98％。

4.6恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。

4.7恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1mg/mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的恩諾沙星、環(huán)丙沙星

和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇配成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液儲(chǔ)備在4℃冰箱中，可保存6個(gè)月。

4.8恩諾沙星、環(huán)丙沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇－水（2＋8，體積比）分別配成濃度范圍

為1ng/mL～60ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)溶液濃度為50ng/mL，現(xiàn)配。

4.9氘代諾氟沙星（NOR－D5）內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液：100μg/mL。稱(chēng)取適量的NOR－D5內(nèi)標(biāo)物（4.5），

用甲醇（4.1）配成100μg/mL儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液儲(chǔ)存在4℃冰箱中。

4.10氘代諾氟沙星（NOR－D5）內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液：1μg/mL。取適量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（4.8），用甲醇

（4.1）稀釋成100μg/mL儲(chǔ)備液，內(nèi)標(biāo)工作溶液在4℃下保存。

4.11氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）：取4g氫氧化鈉，溶解于1L水中。

4.12甲酸-甲醇溶液（5＋95，體積比）：取5mL甲酸（4.3）于80mL水中，混合均勻。

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5儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧粒子源。

5.2分析天平：感量0.001g，0.1mg，各一臺(tái)。

5.3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

5.4固相萃取裝置。

5.5渦旋均混器。

5.6真空泵：真空度不低于80kPa。

5.7濾膜：有機(jī)系，0.45μm。

5.8離心管：100mL，具塞。

6試樣的制備

6.1提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取5g樣品（精確至0.01g），置于100mL離心管中，加經(jīng)灼燒的無(wú)水硫酸鈉，用干凈玻

璃棒將樣品與無(wú)水硫酸鈉攪拌分散均勻，準(zhǔn)確加入1μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液50μL，加入20mL氫氧化鈉溶

液，于渦旋均勻器上快速混勻。以5000r/min的速度離心5min，上清液移入125mL分液漏斗中，加

20mL正己烷混合，渦漩振蕩，靜置分層，取下層水相待凈化。

6.2凈化

依次用3mL甲醇和3mL水活化固相萃取柱，將樣品溶液轉(zhuǎn)移到小柱上，依次用水、甲醇淋洗，

棄去上述濾液。用甲酸-甲醇溶液3mL洗脫。40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇-水定容1.0mL,過(guò)0.45

μm的濾膜到進(jìn)樣瓶中，供液相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。

7測(cè)定步驟

7.1測(cè)定

7.1.1參考液相色譜條件

色譜柱：C18，3μm，150mm×2.0mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者。

流動(dòng)相：甲醇（A）+0.1%甲酸水溶液（B）。

流速：0.20mL/min。

梯度洗脫程序：參見(jiàn)表1。

柱溫：室溫。

進(jìn)樣量：25μL。

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DB13/T1384.7—2011

表1梯度洗脫程序

時(shí)間（min）A（％）B（％）

01090

2.001090

4.009010

8.009010

9.001090

15.001090

7.1.2參考質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源。

掃描方式：正離子掃描。

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

電噴霧電壓、碰撞電壓等自動(dòng)優(yōu)化至最佳值。

定性離子對(duì)、定量離子對(duì)見(jiàn)表2。

表2定性離子對(duì)、定量離子對(duì)

恩諾沙星環(huán)丙沙星諾氟沙星氘代諾氟沙星

360//316332/231320/276

定性離子對(duì)（m/z）325/281

360/245332/288320/302

定量離子對(duì)（m/z）360/316332/231320/276325/281

7.2定性定量

7.2.1定性測(cè)定

進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)樣品一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖

中，各定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖相比，最大允許相對(duì)偏差不

超過(guò)表3中規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。

表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許相對(duì)偏差

相對(duì)離子豐度〉50％〉20％～50％〉10％～20％≤10％

允許的相對(duì)偏差±20％±25％±30％±50％

7.2.2定量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)定條件下分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，

工作溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)（1ng/mL～60ng/mL），用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)對(duì)樣品

進(jìn)行定量，樣品溶液響應(yīng)值均在儀器測(cè)定的線(xiàn)性范圍內(nèi)。在上述色譜條件下，其相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)

離子流色譜圖參見(jiàn)附錄A。

7.3空白實(shí)驗(yàn)

除不加入試樣外，按上述（7.1～7.3）步驟進(jìn)行。

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8結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式（1）計(jì)算：

AX×mS

CX=…………..(1)

AS×M

式中:

CX一一樣品中喹諾酮的濃度，單位為微克每千克（μg/kg）。

AX一一樣品中喹諾酮的封面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比值。

As——標(biāo)準(zhǔn)品中喹諾酮的峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比值。

ms一一喹諾酮的質(zhì)量，單位為納克（g）。

m一一溶解殘余物所得試樣溶液體積，單位為毫升（mL）。

9精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15％。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

MRM色譜圖

圖A.1恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星的MRM色譜圖

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前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、河北省醫(yī)科大學(xué)、北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)

中心、石家莊市疾病預(yù)防控制中心、河北省飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張巖、李揮、呂品、叢斌、盧小宇、張宏、范斌、賈茜、馬春玲、米振杰、楊

立學(xué)、李志平、沈磊、高振同、武英利。