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實(shí)驗(yàn)三

考馬斯亮藍(lán)染色法

測(cè)定蛋白質(zhì)濃度目的要求學(xué)習(xí)考馬斯亮藍(lán)（Coomassiebrilliantblue）法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定蛋白濃度的方法，于1976年由Bradford建立。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。幾種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法考馬斯亮藍(lán)染色法的突出優(yōu)點(diǎn)1、靈敏度高，比Lowry法約高4倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1μg。2、測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5min左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2min即可完成，其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5~20min之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。3、干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法?？捡R斯亮藍(lán)染色法的缺點(diǎn)1、由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用γ-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。2、仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物

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