妊娠早期胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)主要內(nèi)容

妊娠早期胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)主要內(nèi)容摘要：關(guān)鍵詞：妊娠早期胎兒染色體非整倍體胎兒DNA片段孕婦體重早孕期無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)目的：檢測(cè)212名812孕周孕婦血漿樣本用以評(píng)價(jià)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)在早孕期檢測(cè)的可行性。方法：參與本研究的高危孕婦來(lái)自同一家醫(yī)院，運(yùn)用大規(guī)模平行測(cè)序檢測(cè)母體血漿DNA，確定胎兒是否存在21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)、X和Y染色體的非整倍體。所有孕婦均需經(jīng)絨毛膜取樣或羊水穿刺，并通過(guò)核型分析確認(rèn)其N(xiāo)IPT結(jié)果。跟蹤所有NIPT陰性孕婦至分娩，新生兒隨訪(fǎng)對(duì)可能出現(xiàn)的染色體疾病進(jìn)行臨床評(píng)估。結(jié)果：NIPT檢測(cè)出了包括T21(n=2)、T18(n=1)、T13(n=1)在內(nèi)的常染色體非整倍體，并經(jīng)核型分析驗(yàn)證。存在一例45,X假陽(yáng)性和兩例47，XXY和45X[16]/47，XXX[14]假陰性。平均血漿DNA含量為8.54%，胎兒游離DNA含量從8周至12周逐漸遞增。絕大多數(shù)孕婦(95%)血漿中胎兒游離DNA含量超過(guò)NIPT的檢測(cè)下限4%。早孕期胎兒DNA含量與孕婦體重存在輕微的負(fù)相關(guān)(R2=0.186)。結(jié)論：NIPT用于8-12孕周的早孕期檢測(cè)仍有很高的可靠性和準(zhǔn)確性。背景無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)運(yùn)用大規(guī)模平行測(cè)序檢測(cè)胎兒游離DNA，現(xiàn)已作為孕婦常規(guī)產(chǎn)前保健用于多個(gè)國(guó)家1,2。前瞻性臨床研究結(jié)果顯示3-5，NIPT高度可靠，對(duì)T21、T18、T13三種常見(jiàn)的染色體綜合征靈敏度和特異性超過(guò)99%，但是性染色體非整倍體（SCAs）的假陽(yáng)性率和假陰性率卻很高。雙胎消失綜合征（vanishingtwin）、DNA含量過(guò)低或操作失誤可以部分解釋SCAs假陽(yáng)性或假陰性1，不過(guò)胎盤(pán)嵌合6-10和母體染色體異常11才是導(dǎo)致NIPT結(jié)果不符的常見(jiàn)原因。目前，用于NIPT的母血漿樣本通常從10孕周至整個(gè)中孕期取樣1。在這一妊娠期間，胎盤(pán)向母體循環(huán)釋放胎兒游離DNA片段，其含量在10孕周至21孕周維持在10-20%7,12,13。同一孕周的胎兒游離DNA含量往往差異很大7,14,表明不同孕婦之間顯著的生理差異。許多因素會(huì)影響胎兒游離DNA含量，其中孕周、孕婦體重和胚胎數(shù)量1,12,15影響最為顯著。已報(bào)道的前瞻性臨床研究3證實(shí)，NIPT在檢測(cè)中孕期胎兒染色體非整倍體方面具有很高的敏感度和特異性。如果將NIPT擴(kuò)展到早孕期應(yīng)用，就需證實(shí)NIPT在早孕期具有同等的可靠性和精確性。本前瞻性臨床研究共招募212名具有胎兒染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，以評(píng)判NIPT在早孕期8-12孕周的檢測(cè)效果。方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究隨機(jī)招募213名高齡（＞35歲）單胎孕婦（圖1）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院（PUMCH）倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均充分知情。采用Streck管采集8-12孕周的血液樣本，每一樣本配以唯一條碼。孕周通過(guò)末次月經(jīng)計(jì)算，并于孕7-8周時(shí)超聲進(jìn)一步確認(rèn)。受試者和樣本的詳細(xì)臨床信息均被記錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中。絨毛膜取樣或羊水穿刺用于產(chǎn)前診斷確診。NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷均對(duì)受試者免費(fèi)，分別在貝瑞和康和協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行雙盲檢測(cè)。所有NIPT陰性孕婦均最終分娩，并由協(xié)和醫(yī)院兒科醫(yī)師對(duì)新生兒進(jìn)行染色體疾病相關(guān)表型的臨床評(píng)估。侵入性產(chǎn)前診斷胎兒細(xì)胞樣本來(lái)自于絨毛膜取樣（11W-13W+6）或羊水穿刺（18W-21W+6）。隨后細(xì)胞培養(yǎng)，分辨率320條帶的G顯帶技術(shù)分析至少20個(gè)細(xì)胞。非侵入性產(chǎn)前檢測(cè)制備母血漿DNA樣本，構(gòu)建文庫(kù)并添加序列標(biāo)簽，在illuminaHiseq20平臺(tái)上完成測(cè)序，并用已發(fā)表文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析3,16。每個(gè)NIPT樣本產(chǎn)生5M的36bp序列數(shù)據(jù)，其中約3.5M數(shù)據(jù)可唯一比對(duì)到人類(lèi)基因組圖譜。Z-值（-3<Z<3為正常值）用于判斷胎兒24條染色體的非整倍體狀況。NIPT陽(yáng)性樣本均經(jīng)測(cè)序檢測(cè)母血白細(xì)胞（WBC）的拷貝數(shù)變異狀況11，以排除陽(yáng)性來(lái)自于母體嵌合的可能。根據(jù)正常男性血漿樣本中Y染色體比例與懷有正常男性胎兒孕婦血漿中的Y染色體比例的百分比，來(lái)計(jì)算孕婦血漿中男性胎兒的DNA含量14。如早先報(bào)道17,通過(guò)計(jì)算待測(cè)樣本和參考樣本之間胎兒DNA異常染色體的比例來(lái)判斷是否存在染色體非整倍體。結(jié)果2012年5月至2013年8月，共213名>35歲的孕婦同意在北京協(xié)和醫(yī)院參與本研究（圖1）。孕婦平均體重為60.02±8.83kg范圍在41.2-98.0kg）采樣時(shí)孕周范圍為8周-12周+6。試驗(yàn)選擇的212名孕婦中，42名（19.8%）有流產(chǎn)史，13名（6.1%）通過(guò)輔助生殖受孕。在收集完213名孕婦血液樣本并進(jìn)行NIPT后，34名孕婦由于擔(dān)心流產(chǎn)或感染風(fēng)險(xiǎn)而拒絕絨毛膜取樣或羊水穿刺。在這34名孕婦中，8名（23.5%）有流產(chǎn)史，3名（8.8%）為輔助生殖受孕。213份樣本中有1份由于紅細(xì)胞溶解而未通過(guò)QC，后該孕婦未再參與本研究，因此最終參與本研究的為212人。212名孕婦進(jìn)而分為兩個(gè)亞組，較大的一組由178名孕婦組成（組A），她們同時(shí)接受NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷，較小的一組由34名只接受了NIPT的孕婦組成（組B）（圖1）。接受NIPT檢測(cè)的212名孕婦年齡分布和孕周分布見(jiàn)圖2a和圖2b。孕婦平均年齡為37.25歲（年齡范圍為35-45歲），其中182名（85.8%）女性小于40歲。NIPT樣本均來(lái)自于早孕期，平均孕周為9周+6（孕周范圍為8周-12周+6）。但212份樣本中的110份來(lái)自更早的8周-9周+6孕周。國(guó)PUEUtflld國(guó)PUEUtflldoRotnz￡purv￡purv匚牙JO..IID右q已『2

B圖2孕婦群體統(tǒng)計(jì)：A,孕婦群體的年齡分布（平均年黔37.25歲）.=B,.孕婦祥體的孕周分布（平均孕周9周祐）組A的178份樣本檢測(cè)出5例胎兒染色體非整倍體（表1）,包括T21（n=2）、T18（n=1）,、T13（n=1）和45，X（n=1）。隨后的侵入性產(chǎn)前診斷證實(shí)了4例三體綜合征，但1例NIPT結(jié)果為45，X的樣本被證實(shí)為正常的46，XX核型。此外，2例被NIPT檢測(cè)為正常的胎兒經(jīng)侵入性產(chǎn)前診斷證實(shí)為47,XXY和45,XX[16]/47,XXX[14]。因此，NIPT對(duì)性染色體非整倍體存在1例假陽(yáng)性（0.56%）和2例假陰性（1.12%）。對(duì)NIPT檢測(cè)不符的3例性染色體非整倍體（SCAs）進(jìn)行母血漿白細(xì)胞測(cè)序（WBCs），確定母親為正常的46，XX核型，表明NIPT結(jié)果為胎兒特異。所有6名懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦選擇了終止妊娠。其余172名陰性孕婦繼續(xù)妊娠，在北京協(xié)和醫(yī)院或其相關(guān)醫(yī)院分娩，兒科醫(yī)師對(duì)172名新生兒進(jìn)行染色體綜合征的檢查，排除了新生兒患病的可能。侵入性產(chǎn)前診斷和新生兒檢查表明，nipt對(duì)三體綜合征的檢測(cè)高度準(zhǔn)確，靈敏度(95%CI為T(mén)211%(19.79-1%)、T181%(5.46-1%)、T131%(5.46-1%)。特異性(95%CI)為T(mén)211%(97.35-1%)、T181%(97.35-1%)、T131%(97.35-1%)。NIPT對(duì)性染色體檢測(cè)的特異性(95%CI)為99.43%(96.39-99.97%)。表Lnipt陽(yáng)性或不良妊撮荼昌的受試者信息匚總研敖群樣滴號(hào)孕辨齡孕周胎兒DNA含量NIH^果胎J蜘妊娠結(jié)局組A（r=17S）hjiPTfn僵入護(hù)前診斷12B299388S.50%1（男性）47,X￥,+21遂itm.12B0663995.96%TNU女性）4了雙+21終止姮娠12B26241115.45%Tlfi(男性)47rKVta終止垠娠12B156391011.55%T1M女性）47.XX.+13終也I娠laeioo3695.65%45A順XX足月妊娠4296.06%46.XY47.XXY12G256389未御倒45,47JXXX[li]谿itm.蛆B(n-34)任宜NIPT12BOSS361112.53%女性）未做終止妊娠（胎兒死12B26842114.80%T2(女性)未撤摟（胎兒死1207^839811.B5%45應(yīng)未做終iBtf娠（心臟畸形）12B0313S97.42%46rX￥未做12B1753510未檢刪到未伐自痢苛12B1763597.%46.XY未做自墉秒12G2S637106.54%未做12B3833710B.27%46.XY未伐在拒絕進(jìn)行產(chǎn)前診斷的34名孕婦（組B）中，NIPT檢測(cè)到3例染色體非整倍體，分別為T(mén)21、45，X和T2（表1）。由于胎兒死亡或存在明顯的心臟異常，孕婦選擇了終止妊娠。另有5名孕婦在NIPT取樣后的1-2周發(fā)生了自然流產(chǎn)。遺憾的是，發(fā)生自然流產(chǎn)的孕婦未在協(xié)和醫(yī)院留下記錄，因此沒(méi)有相應(yīng)的流產(chǎn)組織來(lái)證實(shí)NIPT結(jié)果。其余26名NIPT正常的孕婦順利分娩，并由兒科醫(yī)生對(duì)新生兒進(jìn)行檢查，排除了其患有染色體綜合征的可能。我們對(duì)1份（47.2%）懷有男性胎兒的孕婦血漿樣本（圖3）進(jìn)行二次分析，以確認(rèn)胎兒游離DNA含量與早期孕周的關(guān)系。8-12孕周的平均胎兒DNA含量為8.54%，廣泛的分布在2.69%-18.75%。從8周到12周，胎兒游離DNA含量呈現(xiàn)輕微的上升，但8周、9周、10周和12周的胎兒DNA含量方差分析沒(méi)有顯著性差異（p=0.18）。具有重要臨床意義的是，1份樣本中有5份（5%）胎兒游離DNA含量低于4%（檢測(cè)染色體非整倍體的切割值），其孕周分別為8周+1、10周、11周+1、12周+4和12周+6。1份樣本的胎兒DNA含量與孕婦體重（圖4）呈負(fù)相關(guān)（R2值為0.186（p<0.1））。5份胎兒DNA含量低于4%的樣本，孕婦體重均高于群體平均值。國(guó)m.旦孕期盼兒ONA國(guó)m.旦孕期盼兒ONA含量分布.IB。名懷有另性怕凡孕掃的平均SHJLdna^-S；學(xué)3閉為

7.09%：孚9云為玷1%，孕：.習(xí)為？W褊3111^^7,53%-孕亶.田為9.1814*方菱分析昱

周'9周、F周、”捆的臘兒DMA含址沒(méi)有E奢差異（p=O.ia）PwODDIR=-O.431weigh!出#i圈4.分析1全懷有男性胎幾孕婦的體重與脂兒CINA含量的關(guān)系.運(yùn)用皮爾遜相關(guān)性分析孕婦體重和胎兒DNA含量?jī)烧咧g的關(guān)聯(lián)。圖中三角形標(biāo)識(shí)顯示胎兒DNA含量低于4%。討論在對(duì)212名孕婦胎兒染色體非整倍體的初步研究中，評(píng)估了NIPT用于早孕期的檢測(cè)效果。178名孕婦同時(shí)接受了NIPT和侵入性產(chǎn)前診斷，34名孕婦只接受7NIPT?；?78份的NIPT、產(chǎn)前診斷以及新生兒隨訪(fǎng)結(jié)果，NIPT檢測(cè)T21、T18和T13沒(méi)有出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。不過(guò)NIPT另有1例SCA假陽(yáng)性和2例SCAs假陰性，假陽(yáng)性率和假陰性率分別為0.56%和1.12%?？傮w來(lái)看，本項(xiàng)針對(duì)早孕期高危人群的NIPT研究，取得了與近期報(bào)道的1741例中國(guó)孕婦、1982例廣東孕婦和1914例美國(guó)孕婦4的三個(gè)前瞻性試驗(yàn)相一致的檢測(cè)靈敏度和特異性，不過(guò)這三個(gè)試驗(yàn)的血液樣本均采集于中孕期。為了解釋3例與核型分析不一致的NIPT結(jié)果，我們對(duì)所有NIPT結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧°45，X假陽(yáng)性案例中的胎兒DNA含量為較低的5.65%，但仍足夠進(jìn)行精確的NIPT檢測(cè)。推測(cè)這例NIPT不一致是由45，X限制性胎盤(pán)嵌合（CPM）造成，此現(xiàn)象在最近一篇47,XXX的案例中報(bào)道過(guò)10。遺憾的是，嬰兒出生后我們沒(méi)有得到相關(guān)的胎兒組織進(jìn)行驗(yàn)證。47，XXY假陰性孕婦通過(guò)IVF移植兩個(gè)未知性別的胚胎而受孕，盡管6.06%的胎兒DNA含量相對(duì)較低，但NIPT未檢出的原因可能是雙胎消失的男性胎兒對(duì)胎兒游離DNA含量額外貢獻(xiàn)了46,XY序列，這有效的中和了本應(yīng)從存活的47，XXY胎兒中獲得的額外X染色體片段。孕7周價(jià)hCG檢測(cè)為64659mIU/ml，這一水平與消失的雙胎水平接近18，這也支持了上述假設(shè)。此外，孕7周的超聲顯示存在兩個(gè)孕囊和一個(gè)胎心，這也意味著存在一個(gè)未能存活的胎兒。第二例NIPT假陰性的胎兒核型為45,X[16]/47,XXX[14]嵌合體，進(jìn)入血液循環(huán)的X染色體片段被相對(duì)等量的45,X和47，XXX所中和，故NIPT得出正常女性的結(jié)論。盡管如此，這樣的極端案例表明NIPT不能全部檢出實(shí)際為嵌合體的胎兒。大部分的T21、T18和T13三體綜合征的胎兒會(huì)在早孕期死亡，表現(xiàn)為自然流產(chǎn)19。34名沒(méi)有接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦群體中，NIPT檢測(cè)到T21、T2和45，X三個(gè)陽(yáng)性胎兒，其胎兒游離DNA含量分別為12.53%>4.8%和11.85%。根據(jù)臨床記錄，T21和T2兩個(gè)胎兒在NIPT取樣后幾天就停止了發(fā)育，45,X的胎兒繼續(xù)發(fā)育但卻出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟畸形。這三個(gè)案例中的胎兒都進(jìn)行了人工流產(chǎn)，但并未保留胎兒流產(chǎn)組織驗(yàn)證NIPT結(jié)果。同時(shí)此組另有5例NIPT陰性的胎兒發(fā)生了自然流產(chǎn)，這5例樣本的胎兒DNA含量在6.94-8.27%之間。由此8個(gè)案例可發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是胎兒生長(zhǎng)停滯還是自然流產(chǎn)都不是導(dǎo)致胎兒游離DNA含量低于檢測(cè)極限4%的原因。在對(duì)1名男性胎兒的研究中發(fā)現(xiàn)，8-12孕周平均胎兒DNA含量為8.54%,5%樣本的胎兒DNA含量低于4%檢測(cè)切割值。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在8周、9周、10周和12孕周胎兒游離DNA含