第10章DNA的生物合成

DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)復(fù)制(replication)

是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)復(fù)制的方式——半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制時，親代DNA雙螺旋解開，然后以每條鏈為模板，按堿基互補(bǔ)原則合成與模板鏈互補(bǔ)的新鏈。結(jié)果新形成的兩個子代DNA雙螺旋分子中有一條鏈來自親代，另一條是新合成的，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。子代DNA雙螺旋與親代DNA的堿基順序完全一樣一、半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征半保留復(fù)制的概念:模板原則特點(diǎn)親代的DNA雙鏈，每股鏈都可作為模板按堿基互補(bǔ)配對原則指導(dǎo)新鏈的合成合成的兩個子代DNA分子堿基順序與親代分子完全一樣一條鏈來自于親代的DNA鏈，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻逆淎GGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式

CsCL密度梯度離心浮力密度

15N－DNA1.742g/ml14N－DNA1.710g/ml1958年Meselson和Stahl用同位素15N標(biāo)記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復(fù)制。細(xì)胞培養(yǎng)在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中（連續(xù)培養(yǎng)12代，使所有DNA分子均標(biāo)記上15N）轉(zhuǎn)入正常N源（14N）培養(yǎng)基中分離各代DNA,分析其浮力密度半保留復(fù)制的實驗證據(jù)——實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。復(fù)制起點(diǎn)（origin，ori或o，復(fù)制原點(diǎn)）

：復(fù)制開始處DNA分子的特定位置復(fù)制子(Replicon)（復(fù)制單位）：從一個起點(diǎn)到一個終點(diǎn)所包含的DNA區(qū)域。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。二、DNA復(fù)制從起始點(diǎn)向兩個方向延伸形成雙向復(fù)制原核生物染色體DNA

：單復(fù)制起點(diǎn)

——原核生物基因組是環(huán)狀DNA，整個染色體只有一個復(fù)制單位

真核生物染色體DNA:多復(fù)制起點(diǎn)

——一個genome中有多個復(fù)制單位許多生物的復(fù)制起點(diǎn)都是富含A、T的區(qū)段大多數(shù)是雙向的，形成兩個復(fù)制叉；復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)（Y字形結(jié)構(gòu)）.復(fù)制叉上分布著許多與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子真核染色體DNA

線環(huán)狀雙鏈E.coli染色體DNA

環(huán)狀雙鏈

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛。A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制3’真核生物每個染色體有多個起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。

復(fù)制過程中SV40DNA分子的電鏡照片三、DNA一股子鏈復(fù)制的方向與解鏈方向相反導(dǎo)致半不連續(xù)復(fù)制在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3’5’方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5’3’方向連續(xù)合成，另一股以5’3’為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以5’3’方向合成1000—2000個核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段），這種復(fù)制方式稱之為半不連續(xù)復(fù)制。3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(laggingstrand)

。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。一、核苷酸和核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3

方向進(jìn)行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′

AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA復(fù)制時5’→3’外切酶活性切除RNA引物，5’→3’聚合酶活性填補(bǔ)其留下的空隙;DNA損傷修復(fù)；DNA損傷修復(fù)(紫外光引起)DNA復(fù)制的主要酶——5’→3’聚合活性催化鏈的延長3’→5’外切酶活性的校對功能原核生物的DNA聚合酶（三種酶的不同點(diǎn)）功能：DNA-polⅠ（109kD）對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓撸词乖谝寻l(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。催化DNA聚合--延長參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞基數(shù)--+5

外切酶活性+++

5

外切酶活性+++5

聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶（二）常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有五種DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校讀活性和堿基選擇功能是復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來保證復(fù)制的保真性。（一）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯配堿基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來的酶，外切酶是有方向性的。DNApolⅠ的校讀功能A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。（二）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。

遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：四、復(fù)制中的分子解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase)——復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。解螺旋酶108局部解鏈后（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈復(fù)制過程正超螺旋的形成：解鏈過程中正超螺旋的形成既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制：五、DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶的作用：DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：提供核糖3

-OH提供5

-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓?fù)涿盖袛?、整理后的兩鏈改變拓?fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3

,5

-磷酸二酯鍵生成的比較

DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成1.DNA解鏈

E.Coli上有一個固定的復(fù)制起始點(diǎn)，成為oriC

，這段DNA上有3組串聯(lián)重復(fù)序列（識別區(qū)）和2對反向重復(fù)序列（富含AT區(qū)）DNA雙鏈中，AT配對多的地方容易解鏈?！獭獭獭藾NA解成單鏈

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

2、引發(fā)體的形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA的起始復(fù)制區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶（二）復(fù)制的延長過程：領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-polDNA復(fù)制的延長解鏈方向即酶的前進(jìn)方向，領(lǐng)頭鏈的復(fù)制先于隨從鏈，與解鏈方向相同。領(lǐng)頭鏈的合成隨從鏈的子鏈延長方向與解鏈方向相反，復(fù)制延長中，需要不斷生成引物。原核生物岡崎片段長度為1000-2000個核苷酸。隨從鏈的合成在同一復(fù)制叉上，領(lǐng)頭鏈的復(fù)制先于隨從鏈，但兩條鏈?zhǔn)窃谕籇NA聚合酶III催化下進(jìn)行延長的。因為隨從鏈的模板DNA可以折疊或繞成環(huán)狀，因而與領(lǐng)頭鏈正在合成的區(qū)域?qū)R。階段一階段二階段三階段四復(fù)制過程簡圖復(fù)制的延長原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。（三）復(fù)制的終止：切除引物、填補(bǔ)空缺、鏈接切口oriter

E.coli8232

ori

terSV405005

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接復(fù)制的終止逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶活性：RNA或DNA做模板的dNTP聚合活性和RNase活性。RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立繁殖。在某些情況下，前病毒基因組通過基因重組(recombination)，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達(dá)。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨(dú)立繁殖或整合，都可成為致病的原因。逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT試管內(nèi)合成cDNAcDNA

complementaryDNA以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

--發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)DNA突變具體指個別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。一、突變在生物界普遍存在（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)從長遠(yuǎn)的生物史看，進(jìn)化過程是突變的不斷發(fā)生所造成的。大量的突變都是屬于這種類型，只是目前還未能認(rèn)識其發(fā)生的真正原因，因而名為自發(fā)突變或自然突變(spontaneousmutation)。（二）只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性這種突變沒有可察覺的表型改變，例如在簡并密碼子上第三位堿基的改變，蛋白質(zhì)非功能區(qū)段上編碼序列的改變等。這些現(xiàn)象也相當(dāng)普遍。多態(tài)性(polymorphism)一詞用來描述個體之間的基因型差別現(xiàn)象。（三）致死性的突變可導(dǎo)致個體、細(xì)胞的死亡

（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)二、引發(fā)突變的因素物理因素紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射UV化學(xué)因素目錄三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)：點(diǎn)突變?nèi)笔?deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

轉(zhuǎn)換

顛換

鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因（一）錯配谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙