牛環(huán)形泰勒蟲suAT1基因的克隆和原核表達

牛環(huán)形泰勒蟲suAT1基因的克隆和原核表達

引言：

牛環(huán)形泰勒蟲（Taeniasaginata）是一種寄生于牛的節(jié)肢動物病原體，常引發(fā)人類腸道疾病—腸道絳蟲病。其中，suAT1基因在牛環(huán)形泰勒蟲成蟲體內(nèi)高度表達，并且在感染宿主時起到重要的生物學(xué)功能。本研究旨在克隆牛環(huán)形泰勒蟲suAT1基因，并在大腸桿菌中進行原核表達。

方法：

1.基因克?。簭呐－h(huán)形泰勒蟲成蟲的全長cDNA中，通過PCR方法擴增suAT1基因的核苷酸序列。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA1μg，引物0.5μM，TaqDNA聚合酶0.5U，反應(yīng)緩沖液2.5μL，dNTP混合物0.4mM，離子氯化物50mM，Mg2+2.5mM，去離子水補至總體積為50μL。PCR條件為：預(yù)變性5min，95°C；變性45s，95°C；退火45s，58°C；延伸1min，72°C，共35個循環(huán)；最后延伸10min，72°C。

2.構(gòu)建原核表達載體：將擴增得到的suAT1基因通過限制性內(nèi)切酶切割后與pET-28a(+)載體連接。

3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性菌落并高倍純化重組質(zhì)粒。

4.培養(yǎng)大腸桿菌：將重組菌株接種至LB培養(yǎng)基中，在37°C恒溫搖床上以200rpm進行搖菌培養(yǎng)，直至細菌生長到對數(shù)期（OD600=0.6-0.8）。

5.ITPG誘導(dǎo)表達：將異源表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21(DE3)中，接種到LB培養(yǎng)基中進行搖菌培養(yǎng)。生長到對數(shù)期后，添加最終濃度為0.5mM的異丙基β-D-硫代半乳糖苷（ITPG）誘導(dǎo)表達，繼續(xù)在搖床上培養(yǎng)。

6.蛋白表達與純化：使用海藍蛋白親和層析法純化表達的融合蛋白，將相關(guān)洗脫液進行SDS凝膠電泳分析。

7.Westernblot檢測：將純化的融合蛋白轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺凝膠中，進行Westernblot檢測。

結(jié)果：

成功從牛環(huán)形泰勒蟲成蟲的全長cDNA中克隆得到suAT1基因的核苷酸序列。對suAT1基因進行限制性內(nèi)切酶切割后，與pET-28a(+)載體連接，得到了suAT1基因的原核表達載體。經(jīng)過轉(zhuǎn)化與篩選，成功獲得了重組菌株，并通過RT-PCR檢測驗證了suAT1基因在大腸桿菌中的表達情況。經(jīng)過搖床培養(yǎng)和ITPG誘導(dǎo)，成功實現(xiàn)了suAT1基因在大腸桿菌中的表達，并進行了融合蛋白的純化工作。經(jīng)過SDS凝膠電泳分析和Westernblot檢測，證實融合蛋白的表達和純化達到了預(yù)期。

討論：

suAT1基因在牛環(huán)形泰勒蟲中具有重要的生物學(xué)功能，其克隆和表達對于深入研究該基因的功能起到了關(guān)鍵的作用。通過本研究的方法，成功獲得了suAT1基因的全長cDNA序列，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達。這為進一步研究suAT1基因的調(diào)控機制、生物學(xué)功能以及其與宿主相互作用奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)論：

本研究成功克隆了牛環(huán)形泰勒蟲suAT1基因，并實現(xiàn)了在大腸桿菌中的原核表達。這為進一步探究suAT1基因的生物學(xué)功能以及與宿主相互作用提供了條件。未來的研究可以通過獲得suAT1基因的重組蛋白，進一步進行功能研究和宿主免疫學(xué)研究，為防治牛環(huán)形泰勒蟲感染提供理論依據(jù)本研究成功克隆了牛環(huán)形泰勒蟲suAT1基因，并通過pET-28a(+)載體在大腸桿菌中實現(xiàn)了suAT1基因的原核表達。經(jīng)過RT-PCR檢測驗證了suAT1基因在大腸桿菌中的表達情況，并通過搖床培養(yǎng)和ITPG誘導(dǎo)成功實現(xiàn)了suAT1基因的表達。融合蛋白的純化工作經(jīng)過SDS凝膠電泳分析和Westernblot檢測證實達到了預(yù)期。本研究的方法為進一步研究suAT