雙水相體系是怎樣形成的其分配機理是什么什么雙水相

雙水相體系是怎樣形成的？其分配機理是什么？什么雙水相萃??？雙水相體系的相圖？雙水相萃取的原理是什么？特點是什么？影響雙水相萃取體系的因素有哪些？其應(yīng)用范圍是什么？2.3雙水相萃取2.3.1雙水相體系的形

成與分配2.3.2雙水相萃取分離的原理2.3.3雙水相萃取體系的影響因素2.3.4雙水相萃取操作及特點2.3.5雙水相萃取的應(yīng)用

掌握：

了解：

重點：

難點：本節(jié)要點及學(xué)習(xí)要求雙水相體系的形成與分配機理雙水相萃取分離的原理雙水相體系中的分配平衡：靜電作用、疏水作用。聚合物的不相溶性、系線、雙節(jié)線、臨界點。影響物質(zhì)分配平衡的因素：

雙水相中聚合物組成的影響；雙水相系統(tǒng)物理化學(xué)性質(zhì)的影響；鹽和緩沖液的影響；溫度的影響。雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用。雙水相體系的形成與分配機理，雙水相萃取分離的原理和特點。雙水相體系的形成與分配機理。雙水相萃取技術(shù)(two-aqueousphaseextraction,ATPS)又稱水溶液兩相分配技術(shù)(1)概述：

基因工程產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶的特點:

傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合。反膠束的辦法可克服這些問題，但存在大量使用有機相和相的分離問題。基因工程產(chǎn)品的商業(yè)化迫切需要開發(fā)適合大規(guī)模生產(chǎn)的、經(jīng)濟(jì)簡便的、快速高效的分離純化技術(shù)。2.3.1雙水相體系的形成與分配活性和功能對pH值、溫度和離子強度等特別敏感；在有機溶劑中的溶解度低并且會變性。技術(shù)誕生1896年Beijerinck觀察到

先得到一渾濁不透明溶液，隨后分為兩相,水相也可以分為兩相，即雙水相系統(tǒng)?將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一個水相中__雙水相萃取.開始于本世紀(jì)70年代，現(xiàn)已應(yīng)用到酶、核酸、生長激素、病毒等分離提純。近年來出現(xiàn)的引人注目、極有前途的新型分離技術(shù)。明膠-瓊脂水溶液混合明膠-淀粉水溶液混合2.3.1雙水相體系的形成與分配(2)雙水相體系雙水相在一定濃度范圍密度不同兩相兩相均含有較多的水明膠-瓊脂水溶液混合明膠-淀粉水溶液混合葡聚糖-甲基纖維素親水性高分子聚合物水水溶液2.3.1雙水相體系的形成與分配向水相中加入高分子化合物PEG/葡聚糖或鹽，在一定組成范圍內(nèi)，可以形成密度不同的兩相。輕相富含高分子化合物PEG，重相富含鹽或高分子化合物Dx葡聚糖。舉例2.3.1雙水相體系的形成與分配葡聚糖-甲基纖維素鈉兩相體系2.3.1雙水相體系的形成與分配0.39%葡聚糖0.65%甲基纖維素鈉98.96%水1.58%葡聚糖0.15%甲基纖維素鈉98.27%水聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇、Dex硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基甲基纖鈉鹽聚乙二醇磷酸鉀、硫酸銨硫酸鈉、硫酸鎂

幾種典型的雙水相系統(tǒng)2.3.1雙水相體系的形成與分配各種雙水相體系2.3.1雙水相體系的形成與分配聚合物1聚合物2或鹽聚合物1聚合物2或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇乙基羥乙基纖維素葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇羥丙基葡聚糖葡聚糖聚乙烯吡咯烷酮羥丙基葡聚糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇聚丙二醇甲氧基聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮磷酸鉀聚乙烯吡咯烷酮葡聚糖聚蔗糖聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮甲基纖維素聚乙二醇硫酸鎂硫酸銨硫酸鈉甲酸鈉酒石酸鉀鈉羥丙基葡聚糖葡聚糖甲基纖維素羥丙基葡聚糖葡聚糖(3)雙水相體系的類型雙聚合物體系常用PEG/Dx聚合物與無機鹽體系

如PEG/磷酸鉀表面活性劑-表面活性劑親和配基-高聚物,親和雙水相萃取2.3.1雙水相體系的形成與分配雙聚合物體系聚合物/鹽體系活性損失小大鹽濃度低高成本高低粘度大小環(huán)境污染無廢水處理困難其它分相困難界面吸附多比較2.3.1雙水相體系的形成與分配4.聚合物雙水相形成機理兩個因素體系熵的增加單一相富含不同聚合物的兩相聚合物的不相容性一定濃度范圍空間位阻,相互排斥雙相兩種聚合物相互混合分離混合分相2.3.1雙水相體系的形成與分配(5)雙水相萃取分離的原理生物分子在雙水相體系中的選擇性分配分配規(guī)律服從能特特分配定律.與溶劑萃取比,表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù).→相圖2.3.1雙水相體系的形成與分配雙水相體系的相圖a系線雙節(jié)線均相區(qū)兩相區(qū)臨界點TB2.3.1雙水相體系的形成與分配K臨界點TKB雙節(jié)線雙水相體系的相圖?N節(jié)線M’B’T’單相雙相2.3.1雙水相體系的形成與分配M點,兩相T和B的量之間的關(guān)系(體積)服從杠桿規(guī)則，即

系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度，系線越長，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長度趨向于零時，即在圖b的雙節(jié)線上K點，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此K點稱為臨界點(criticalpoint)。2.3.1雙水相體系的形成與分配2.3.2.1雙水相分配系數(shù)分配系數(shù)取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用。包括：靜電作用疏水作用生物親和作用。分配系數(shù)是各種相互作用力的和。

lnm=lnme+lnmh+lnml2.3.2雙水相萃取體系的影響因素2.3.2.2影響分配系數(shù)的因素分析1）成相聚合物

---相對分子質(zhì)量和濃度影響分配平衡.對于成相聚合物系統(tǒng)和生物大分子來說：A聚合物的分子量降低上相分子量降低下相分子量降低生物大分子該相溶解度增大形成雙水相所需的濃度越高分配系數(shù)增大分配系數(shù)降低B成相聚合物的濃度越高兩相體系距離臨界越遠(yuǎn)分配系數(shù)增大。2.3.2雙水相萃取體系的影響因素2）鹽的種類和濃度---主要影響相間電位和蛋白質(zhì)疏水性。在雙聚合物雙水相系統(tǒng)中無機離子分配系數(shù)相間電位不同影響帶電蛋白質(zhì)、核酸生物大分子的分配系數(shù)鹽種類2.3.2雙水相萃取體系的影響因素影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，改變各相成相物質(zhì)組成和相體積比.分配系數(shù)隨鹽濃度增加而增加,不同蛋白質(zhì)增加不同.鹽濃度調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)的鹽濃度，可有效萃取分離不同的蛋白質(zhì)PEG/KPi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重相)的PEG和磷酸鉀濃度以及Cl離子在上、下相中的分配平衡隨添加NaCl濃度的增大而改變。2.3.2雙水相萃取體系的影響因素3）pH值4）溫度溫度影響相圖,規(guī)?；僮鞑捎贸?一般雙水相系統(tǒng)來說，溫度的影響很小。蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)磷酸鹽的解離改變影響pH值分配系數(shù)系統(tǒng)的相間電位和蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。影響改變2.3.2雙水相萃取體系的影響因素2.3.2雙水相萃取體系的影響因素溫度的影響溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，不需冷卻。這是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會發(fā)生失活或變性；(2)常溫下溶液粘度較低，容易相分離；(3)常溫操作節(jié)省冷卻費用。2.3.2雙水相萃取體系的影響因素6)雙水相體系物理化學(xué)性質(zhì)的影響：

雙水相系統(tǒng)的性質(zhì)主要取決于下列物理化學(xué)參數(shù)：

密度(ρ)和兩相間的密度差黏度(μ)和兩相間的黏度差以及表面張力(σ)相間電勢差,相分離時間等。5)低分子量化合物:高濃度時起作用。2.3.2雙水相萃取體系的影響因素系線長度代表了系統(tǒng)達(dá)到平衡時上、下相和總組成的關(guān)系，在臨界點附近系線的長度趨向于零，上相和下相的組成相同，因此,分配系數(shù)應(yīng)該是1。界面張力增加→系線的長度增加,上相和下相相對組成的差別就增大，這將會極大地影響產(chǎn)物如酶分配系數(shù)，使酶富集于上相。2.3.2雙水相萃取體系的影響因素2.3.3.1雙水相系統(tǒng)的選擇選擇原則：根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)和共存雜質(zhì)的表面疏水性、相對分子質(zhì)量、等電點和表面電荷等性質(zhì)上的差別綜合利用靜電作用、疏水作用,添加適當(dāng)種類和濃度的鹽，可選擇性萃取目標(biāo)產(chǎn)物。2.3.3雙水相萃取操作及特點目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的等電點不同，調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH值，添加適當(dāng)鹽，產(chǎn)生希望的相間電位。目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的疏水性不同－充分利用鹽析作用增大成相系統(tǒng)濃度－使細(xì)胞碎片選擇性分配于下相。采用相對分子質(zhì)量較大的PEG降低蛋白質(zhì)的分配系數(shù)，提高目標(biāo)蛋白的選擇性。方法2.3.3雙水相萃取操作及特點2.3.3.2雙水相萃取過程包括：雙水相的形成溶質(zhì)在雙水相中的分配雙水相的分離。2.3.3雙水相萃取操作及特點萃取一般操作蛋白質(zhì)在兩相中發(fā)生物質(zhì)傳遞，達(dá)到分配平衡；采用離心沉降進(jìn)行相分離。固體聚合物鹽細(xì)胞勻漿加入攪拌成相物質(zhì)溶解形成雙水相2.3.3雙水相萃取操作及特點圖5-19聚已二醇(PEG)-磷酸鹽雙水相體系萃取酶的一般流程2.3.3雙水相萃取操作及特點兩步萃取法連續(xù)分離胞內(nèi)酶的流程圖2.3.3雙水相萃取操作及特點2.3.3.3雙水相萃取的特點：相混合能耗低，達(dá)到萃取平衡所需的時間短易進(jìn)行工業(yè)放大(10ml離心管的實驗結(jié)果即可放大）適于易失活的蛋白質(zhì)的提取純化（超濾或沉淀）易實現(xiàn)連續(xù)操作－最大特點蛋白質(zhì)下游加工中比較獨特2.3.3雙水相萃取操作及特點可用于多種生物活性物質(zhì)的分離純化1）酶的提取和純化酶主要分配在上相，菌體在下相或界面處.2.3.4雙水相萃取的應(yīng)用表5-7雙水相萃取體系從微生物的破碎細(xì)胞中提取分離酶的實例p842.3.4雙水相萃取的應(yīng)用2）核酸分離純化用PEG/Dextran體系萃取核酸時，鹽組分的微小變化將會引起分配系數(shù)的微小變化。3）人生長激素的提取用PEG40006.6%/磷酸鹽14％體系從E.coli碎片中提取人生長激素（hGH)（hGH)分配在上相，分配系數(shù)6.4，收率60％.2.3.4雙水相萃取的應(yīng)用從E.coli中提取hGH的三級錯流萃取收率為81％2.3.4雙水相萃取的應(yīng)用4）β干擾素（β-IFN)的提取不用PEG/Dextran體系用PEG－磷酸酯/鹽的體系才能使β-IFN分配在上相，雜蛋白分配在下相。層析技術(shù)雙水相萃取結(jié)合雙水相萃取，層析純化工業(yè)生產(chǎn)2.3.4雙水相萃取的應(yīng)用5）病毒的分離純化6）生物活性物質(zhì)的分析檢測