DB21-T 3007-2018絨山羊胚胎移植技術(shù)操作規(guī)程

ICS65.020.30

B43

備案號：61301-2019DB21

遼寧省地方標準

DB21/T3007—2018

絨山羊胚胎移植技術(shù)操作規(guī)程

Regulationsforoperationtechnologyofembryotransferofcashmeregoat

DB21/T3007—2018

絨山羊胚胎移植技術(shù)操作規(guī)程

1范圍

本規(guī)程規(guī)定了遼寧絨山羊胚胎移植技術(shù)的操作規(guī)范。

本規(guī)程適用于遼寧絨山羊胚胎生產(chǎn)及移植技術(shù)操作。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T4630遼寧絨山羊

NY/T826-2004綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程

NY/T1571-2007羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程

NY/T1674-2008牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程

NY/T2893-2016絨山羊飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

絨山羊cashmeregoat

原產(chǎn)于遼寧省遼東半島山區(qū)，體表長絨毛的山羊。

3.2

巴氏玻璃管Pasteurizedglasstube

即巴斯德玻璃管，是一種兩端開口的玻璃管，一般用于轉(zhuǎn)移液體。

4羊只選擇與管理

4.1羊只選擇時間與數(shù)量比例

胚胎移植前15d～30d，選擇供體羊、受體羊以及種公羊。供體羊與受體羊的數(shù)量比例為1︰5～6。

4.2供體羊、受體羊選擇與飼養(yǎng)管理

供體羊為年齡2周歲～5周歲的經(jīng)產(chǎn)母羊，且符合遼寧絨山羊GB/T4630一級以上標準，系譜清楚準

確，健康無病，膘情適中，產(chǎn)羔后4個月以上，連續(xù)觀察到2個以上正常發(fā)情周期。供體超排處理前15d

內(nèi)不做免疫，單獨組群飼養(yǎng)。

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DB21/T3007—2018

受體羊為年齡2周歲～5周歲的經(jīng)產(chǎn)母山羊，健康無病，膘情適中。產(chǎn)羔3個月以上，連續(xù)觀察到2

個以上正常發(fā)情周期。同期發(fā)情處理前15d內(nèi)不做免疫，單獨組群飼養(yǎng)。

供體羊與受體羊處理前15d～30d，除按照NY/T2893—2016標準飼養(yǎng)管理要求投喂飼料外，額外

補飼胡蘿卜0.5Kg～0.6Kg/天·只，避免應激。

4.3種公羊選擇與飼養(yǎng)管理

與配種公羊年齡2周歲～6周歲，符合遼寧絨山羊GB/T4630特級以上標準，系譜清楚準確。健康無

病，膘情適中，性欲旺盛，上一年度有繁殖記錄。

種公羊配種前15d～30d，除按照NY/T2893—2016標準飼養(yǎng)管理要求投喂飼料外，需額外補飼胡

蘿卜0.8Kg～1Kg/天·只，雞蛋3枚～5枚/天·只，驅(qū)趕運動30min～40min/次，上下午各1次；配種

前1周～2周開始排精，3次～5次/周。

4.4試情公羊選擇與管理

年齡2周歲～5周歲，性欲旺盛，健康無病，膘情適中。與供體羊、受體羊試情時，試情公羊要佩戴

試情布或試情板，防止誤配。

5超數(shù)排卵與同情發(fā)情

5.1試劑耗材

供體羊超數(shù)排卵與同期發(fā)情試劑耗材：促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)或促黃體素釋放激素A3

（LHRH-A3）、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、氯前列烯醇(PG)、維生素A+D+E注射液等；羊用孕酮陰道栓

（CIDR）及放置槍、75%酒精棉球、0.9%生理鹽水、5mL注射器。

受體羊同期發(fā)情試劑耗材：LHRH-A3、PMSG、PG、維生素A+D+E注射液等；羊用CIDR及放置槍、75%

酒精棉球、0.9%生理鹽水、5mL注射器。

5.2供體羊超數(shù)排卵與同期發(fā)情

胚胎移植一般宜在9月至11月進行。根據(jù)超數(shù)排卵及同期發(fā)情技術(shù)操作推薦程序（附錄A），放栓時

每只羊肌肉注射維生素A+D+E2mL～3mL。利用放置槍將CIDR栓呈水平狀態(tài)放入羊只生殖道內(nèi)，操作過

程中嚴格消毒。放置CIDR栓當天計為0d。第11d開始每只羊肌肉注射FSH1mL（15mg～20mg）/次，

共8次，肌肉注射PG0.7mL～1mL。撤栓后12h開始公羊試情，間隔6h～8h；供體羊接受試情公羊爬

跨時，判定為發(fā)情，種公羊及時配種，首次配種后供體羊靜脈注射LH50IU～100IU或肌肉注射促黃體

素釋放激素A320ug～25ug,每天配種3次～4次，直至供體羊不接受爬跨為止。記錄供體羊發(fā)情時間及

配種時間。

5.3受體羊同情發(fā)情

與供體羊同步實施同期發(fā)情。放栓時肌肉注射維生素A+D+E2mL～3mL/只。按照同期發(fā)情技術(shù)程

序肌肉注射PMSG200IU～250IU/只，撤栓。同期發(fā)情技術(shù)操作推薦程序見附錄A。

6胚胎移植

6.1準備

6.1.1胚胎操作液

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DB21/T3007—2018

胚胎操作液用于胚胎沖取、揀胚、鑒定和移植等，一般選用磷酸鹽緩沖液（PBS）。PBS液可使用市

售成品或自行配制，主要成份與配制方法見附錄B。

6.1.2手術(shù)器械

可升降式羊用手術(shù)車、可移動式手術(shù)器械車、無影燈、水浴鍋。手術(shù)盤，手術(shù)刀柄與刀片，直頭及

彎頭止血鉗，直頭及彎頭手術(shù)剪，持針鉗，固定鉗，剃須刀片，鑷子，中號圓針，中號棱針等器械，將

上述器械用蒸餾水清洗干凈，牛皮紙包裝后，120℃、30min條件下高壓滅菌后待用；術(shù)前在0.1%

新潔爾滅液中浸泡30min，使用前用滅菌的0.9%生理鹽水沖洗。

6.1.3手術(shù)藥品與耗材

甲硝唑注射液、青鏈霉素、碘酊（棉球）、75%酒精（棉球）、礦物油、獸用麻醉藥846合劑、獸

用蘇醒藥鹽酸苯惡唑、結(jié)晶磺胺、新潔爾滅、0.9%生理鹽水；乳膠手套、手術(shù)服、口罩、鞋套、手術(shù)

無菌洞巾、中號絲線、敷料、噴壺、注射器（50mL、10mL、5mL、1mL）。

6.1.4揀胚、移植設備與耗材

立體顯微鏡、腹腔鏡及配件、水浴鍋、控溫加熱臺、集卵杯、35mm培養(yǎng)皿、10#沖胚管、巴氏玻璃

管、16#套管針、7#輸液器皮針、細玻-塑料管、鈍型針、記號筆、0.22um濾器、微量移液槍(1mL、200

uL)、槍頭（1mL、200uL）、酒精燈、75%酒精、95%酒精、面巾紙、鋁飯盒、白鋼盤等。

巴氏玻璃管等玻璃器具用清水洗凈后，依次采用濃硫酸中浸泡24h、流水沖洗30min、洗滌劑刷洗、

流水沖洗1h、蒸餾水沖洗5次、超純水沖洗5次后，放置于干燥箱中烘干，用牛皮紙包裝，120℃、30min

條件下高壓滅菌待用；鋁飯盒、白鋼盤等依次采用流水、蒸餾水沖洗，槍頭（1mL、200uL）裝盒，用

牛皮紙包裝，120℃、30min條件下高壓滅菌待用。

6.2供體羊胚胎沖取

6.2.1場所要求

待術(shù)羊圈應靠近準備室。準備室是用于手術(shù)羊只保定、剃毛、消毒等術(shù)前處理的場所。手術(shù)室緊挨

準備室，胚胎操作室以窗口與手術(shù)室相通，用于胚胎撿取、鑒定分級及裝移植管等胚胎操作。手術(shù)室與

胚胎操作室術(shù)前紫外線照射消毒1h～2h，室溫保持在20℃～25℃。各室間需采取物理措施隔離，術(shù)

前用0.2%新潔爾滅消毒液對地面噴灑擦拭消毒。

6.2.2胚胎沖取時間

供體羊于計劃周期的第17d，對2～8細胞期胚胎手術(shù)沖取；早期囊胚于第21d沖取。

6.2.3手術(shù)準備

術(shù)前羊只禁食不少于24h，可飲水300mL～500mL，上下午各1次。將羊只仰面保定于手術(shù)架上，

頭下尾上，固定四肢；在乳房延向腹部長約20cm寬約15cm為術(shù)區(qū)，用彎頭手術(shù)剪剪除術(shù)區(qū)絨毛，用剃

須刀片將短毛剃凈，清洗術(shù)區(qū)皮膚、晾干。每只羊按0.01ml/kg體重肌肉注射獸用麻醉藥846合劑，待

羊只頭部自然下垂時，用固定鉗將無菌洞巾四角與皮膚固定，用碘酊（棉球）對皮膚消毒，2min～3min

后75%酒精（棉球）對涂碘酊區(qū)皮膚脫碘。注射麻醉藥后，注意羊只狀況，防止口腔異物窒息。手術(shù)

前用0.1%溶液浸泡3min～5min洗手消毒，再用滅菌生理鹽水沖洗。

6.2.4手術(shù)沖胚

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DB21/T3007—2018

6.2.4.1輸卵管沖胚

在距乳房約5cm的腹中線一側(cè)，避開血管，用手術(shù)刀縱向切開皮膚長約8cm～10cm，用手術(shù)柄將

皮下脂肪及腹肌分離，直至腹膜，零星出血處用敷料壓迫止血，若有血管破裂出血用直頭或彎頭止血鉗

止血，敷料清創(chuàng)。輕輕將腹膜做一切口，用剪刀將腹膜剪開長約5cm～8cm左右切口；術(shù)員手部消毒后，

食指及中指伸入腹腔，將子宮角拉出至創(chuàng)口外，適當牽拉卵巢，觀察排卵情況，做好記錄。將細玻-塑

料管的玻璃管端從左側(cè)輸卵管傘口送入約3cm左右，捏緊傘口與套管并固定，塑料管端準備用集卵杯收

集沖胚的操作液。用7#輸液器皮針在宮管結(jié)合部往輸卵管傘方向30°刺入3cm左右，確定針位于輸卵管

腔內(nèi)，注射器取10mL～20mL胚胎操作液，再與輸液器皮針相連，勻速持續(xù)推注操作液，觀察液體回收

情況，如遇阻力時可調(diào)整皮針或玻璃管位置；沖胚完成后皮針刺入點若出血需用敷料按壓止血，卵巢及

輸卵管表面點滴少許礦物油后，送入腹腔。右側(cè)胚胎沖取同上。兩側(cè)沖取完畢后，腹腔內(nèi)注入甲硝唑液，

關(guān)閉創(chuàng)口。創(chuàng)口沿腹部至乳房方向，用中號圓針、絲線連續(xù)縫合腹膜肌肉層，避免傷及腹腔內(nèi)器官；創(chuàng)

口撒放適量結(jié)晶磺胺粉，用大號棱針、絲線結(jié)節(jié)縫合皮膚層，縫線間距1cm左右；皮膚縫合完畢后，向

其表面噴灑適量碘酊液或碘酊（棉球）消毒，3min～5min后用75%酒精（棉球）脫碘；肌肉注射獸用

蘇醒藥（鹽酸苯惡唑）0.02mL～0.04mL/kg體重。術(shù)后羊只肌肉注射消炎類藥品，每天2次，連續(xù)施藥

3d～7d。胚胎回收及移植記錄表見附件C。

6.2.4.2子宮角沖胚

切口操作同輸卵管沖胚。將左側(cè)子宮角拉出創(chuàng)口，調(diào)整角度位置牽拉卵巢，觀察排卵情況，做好記

錄。用消毒回型針頭在左右子宮角分叉處扎一口，將10#沖胚管往輸卵管方向送入約3cm～5cm，向球

囊內(nèi)注入2mL～4mL空氣，確認充盈的球囊與子宮角腔完全緊實密封，沖胚管另一端與集卵杯相連準備

接收沖胚操作液。在宮管結(jié)合部避開血管扎一口，將16#套管針套管從口往子宮方向送入約3cm～5cm，

確認針位于子宮角腔內(nèi)，捏緊子宮角與套管并固定。注射器取50mL胚胎操作液，與套管另一端相連，

勻速持續(xù)推注操作液，觀察液體回收情況，如遇阻力時可調(diào)整針的位置，沖胚完成若有出血需先敷料按

壓止血后，用35℃生理鹽水清洗，卵巢子與宮角表面滴礦物油，送入腹腔。右側(cè)胚胎沖取同上。其他

縫合等操作同上。胚胎回收及移植記錄表見附件C。

6.3撿胚與鑒定分級

6.3.1準備

打開熱臺電源開關(guān)，設置溫度38.5℃。揀胚管可購買市售成品，也可自制。自制撿胚管時，在火

焰上拉伸巴氏玻璃管，距管肩部2cm～5cm左右火焰烘烤，使之形成30°角；斷針，斷口內(nèi)徑200um～

300um，并做鈍化處理。在3個～5個35mm培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入2mL胚胎操作液，做好編號標記。

6.3.2揀胚

集卵杯靜置3min～5min，立體顯微鏡20×倍率下，根據(jù)胚胎的形態(tài)、大小、折光性辨別尋找胚胎，

注意集卵杯邊緣處胚胎的存在，在揀胚管中先吸入一小段胚胎操作液，再揀取胚胎，放入含胚胎操作液

的35mm皿內(nèi)，一般揀取2遍。撿取完后將胚胎在胚胎操作液中洗滌3遍，操作中要避免胚胎丟失。洗滌

后進行胚胎質(zhì)量檢查，確定胚胎級別，做好記錄。胚胎回收及移植記錄表見附錄C。

6.3.3鑒定分級

立體顯微鏡20×～40×倍率下仔細觀察，根據(jù)胚胎的大小、形態(tài)、色調(diào)，卵裂球大小、數(shù)量、均勻

度，液泡，游離細胞等影響胚胎發(fā)育的因素，結(jié)合獲取時的胚胎階段，綜合鑒定與分級。按照NY/T826

—2004、NY/T1571—2007和NT/T1674—2008的規(guī)定進行胚胎鑒定與分級。各發(fā)育期胚胎圖例見附錄D。

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DB21/T3007—2018

6.4胚胎移植

6.4.1時間

2～8細胞期胚胎第17d手術(shù)移植于第15d發(fā)情受體羊只。早期囊胚第21d移植于第15d發(fā)情受體羊

只。術(shù)前羊只禁食12h～24h。胚胎與受體母羊匹配關(guān)系見附錄E。

6.4.2器械、藥品與耗材

器械、藥品與耗材和供體羊手術(shù)相同。另需黃體酮。移胚管可購買市售成品，也可自制。自制移胚

管時，可將拉制的巴氏玻璃管（見自制揀胚管）另一端與乳膠管相連，乳膠管另一端與1mL注射器相連，

注意連接處要密閉。

6.4.3移植

6.4.3.1胚胎裝移植管

先吸0.2mL空氣，吸入約0.1mL胚胎操作液，再吸入約0.05mL～0.1mL空氣，然后吸入含2枚～3

枚胚胎的操作液0.1mL，吸入約0.05mL～0.1mL空氣，再吸入約0.1mL胚胎操作液，待用。胚胎裝管

方法見圖1。

操作液空氣含胚胎操作液空氣操作液空氣

圖1胚胎裝移植管方法示意圖

6.4.3.2手術(shù)移植方法

6.4.3.2.1輸卵管移植

手術(shù)準備、打開腹腔、縫合等操作同供體羊胚胎沖取手術(shù)。

提拉子宮角觀察卵巢黃體情況，正常黃體為卵巢表面火山口狀紅色突起，一般將胚胎移植到黃體側(cè)，

無黃體不移植；根據(jù)受體羊發(fā)情時間與胚胎發(fā)育階段分級情況確定移植胚胎，一般移植2枚～3枚，胚胎

裝移植管。暴露卵巢和輸卵管傘，在傘與卵巢系膜附近尋找輸卵管口，將裝入胚胎的移胚針送入約2cm～

3cm，勻力慢速推動注射器，將胚胎送入輸卵管，并觀察輸卵管充盈狀態(tài)，未充盈則移植失敗，可重新

移植。肌肉注射黃體酮15mg～25mg，記錄黃體、胚胎情況。見附錄C。

6.4.3.2.2子宮角移植

6.4.3.2.2.1開腹手術(shù)法

手術(shù)準備、打開腹腔、縫合等操作同本文件供體羊胚胎沖取手術(shù)。

確定卵巢黃體、移植胚胎、胚胎裝移植管等操作同輸卵管移植。鈍型針在子宮角避開血管扎一口，

將裝入胚胎的移植針送入約2cm～3cm，確認針位于子宮角腔內(nèi)，勻力慢速推動注射器，將胚胎送入子

宮角。肌肉注射黃體酮15mg～25mg，記錄黃體、胚胎情況。見附錄C。

6.4.3.2.2.2腹腔鏡微創(chuàng)法

手術(shù)準備、縫合等操作同本文件供體羊胚胎沖取手術(shù)。

距乳房3cm～5cm，腹中線兩側(cè)3cm～5cm，避開血管用手術(shù)刀各做1cm～2cm切口，穿刺套管針

從切口穿透肌肉、腹膜直達腹腔，取出穿刺針；另一切口用穿刺針刺入，操作同上，穿刺時要避免傷及

腹內(nèi)臟器，取出穿刺針，從切口送入彎頭止血鉗，備用。打開腹腔鏡，將窺視鏡從套管送入腹腔，止血

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DB21/T3007—2018

鉗配合尋找卵巢并觀察黃體情況，確定卵巢黃體、移植胚胎、胚胎裝移植管等操作同輸卵管移植。用止

血鉗將子宮角牽拉至切口外，鈍型針在子宮角避開血管扎一口，將裝入胚胎的移植針送入約2cm～3cm，

確認針位于子宮角腔內(nèi)，勻力慢速推動注射器，將胚胎送入子宮角。肌肉注射黃體酮15mg～25mg，記

錄黃體、胚胎情況。見附錄C。

7術(shù)后觀察

手術(shù)完成后，解除羊只四肢固定物，輕緩運至待術(shù)羊圈，蘇醒后可站立行走，若出現(xiàn)復眠情況，可

驅(qū)趕促其蘇醒。密切觀察術(shù)后羊只狀態(tài)，異常狀況對癥處理。

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DB21/T3007—2018

AA

附錄A

（資料性附錄）

絨山羊供體羊超數(shù)排卵、供受體同期發(fā)情技術(shù)操作程序與計劃表

周期供體羊受體羊相關(guān)準備

…選擇供體，種公羊，加強飼養(yǎng)管理選擇受體，加強飼養(yǎng)管理試劑耗材選購

肌肉注射維生素A+D+E，放置

0天肌肉注射維生素A+D+E，放置CIDR

CIDR

…注意觀察，及時補栓注意觀察，及時補栓

11天晚8︰00肌肉注射FSH

12天早晚8︰00分別肌肉注射FSH

早晚8︰00分別肌肉注射FSH，早8︰00肌肉注射PMSG；晚8

13天

晚8︰00肌肉注射PG︰00撤栓

14天早晚8︰00肌注FSH，早撤栓下午公羊試情

早8︰00肌注FSH，上下公羊試情，配

15天上下午公羊試情手術(shù)器械耗材準備

種即注LH或A3

胚胎操作液準備，器

16天上下午公羊試情，配種

械耗材消毒

17天2～4細胞胚沖取移植器械清洗處置

胚胎操作液準備，器

…

械耗材消毒

21天囊胚沖取移植器械清洗處置

22天術(shù)后觀察、處置術(shù)后觀察、處置

注：第17d輸卵管沖取胚胎多為2～4細胞期胚胎，相應移植到第15d發(fā)情受體母羊輸卵管；第21d子宮角沖取胚胎

多為囊胚，相應移植到第15d發(fā)情受體母羊子宮角；實際操作中可選擇以上其中一種胚胎移植方法。

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BB

附錄B

（資料性附錄）

PBS成分濃度表與配制方法

成分濃度(按mmol/L)濃度(按g/L)

NaCl136.0mmol/L8.0g/L

KCl2.68mmol/L0.2g/L

KH2PO41.47mmol/L0.2g/L

Na2HPO4·12H2O（Na2HPO4）8.1mmol/L2.89（1.5）g/L

MgCl2·6H2O0.49mmol/L0.1g/L

丙酮酸鈉0.33mmol/L0.036g/L

葡萄糖5.56mmol/L1.0g/L

CaCl2·2H2O（CaCl2）0.9mmol/L0.133（0.1）g/L

BSA4.0mmol/L3.0g/L

青霉素G鉀鹽0.06g/L

硫酸鏈霉素0.05g/L

酚紅0.001g/L

注：配制方法

試劑耗材與設備

NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、丙酮酸鈉、葡萄糖等分析純以上

試劑。電阻值18MΩ以上的超純水，使用前120℃、30min條件下高壓滅菌。牛血清白蛋白（BSA）、

胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素、0.2mol/LNaOH液。1L容量瓶、燒杯、藥匙、微量移液槍（1mL、

200uL）、槍頭（1mL、200uL）、封口膜、0.22um濾器、硫酸紙、PH試紙、注射器（50mL、10ml、

5mL）、離心管（50mL、2mL）等。

超凈工作柜、冰箱、高壓鍋、電子天平（0.0001g精度）等。

配制

按照NY/T826—2004、NT/T1571—2007和NY/T1674—2008標準配制，于胚胎移植手術(shù)前1天配制

好。

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CC

附錄C

（規(guī)范性附錄）

供體羊手術(shù)沖胚、胚胎回收、鑒定分級與受體羊胚胎移植記錄表

供體胚胎回收與鑒定分級情況受體胚胎移植情況

供體羊左側(cè)右側(cè)左側(cè)右側(cè)

供體羊

發(fā)情時2～44～82～44～8備受體羊號/

號/公羊可用未受M數(shù)EBB數(shù)可用未受M數(shù)EBB數(shù)黃胚胎數(shù)/黃胚胎數(shù)/

間/手術(shù)回收胚胎胚胎回收胚胎胚胎注發(fā)情時間/

號胚胎精卵/分數(shù)//分胚胎精卵/分數(shù)//分體發(fā)育階體發(fā)育階

時間總數(shù)數(shù)/數(shù)/總數(shù)數(shù)/數(shù)/手術(shù)時間

數(shù)數(shù)級分級級數(shù)數(shù)級分級級數(shù)段數(shù)段

分級分級分級分級

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DB21/T3007—2018

DD

附錄D

（資料性附錄）

各發(fā)育期胚胎圖例

圖D.1未受精卵

圖D.22細胞期胚胎

圖D.34細胞期胚胎

1

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圖D.48細胞期胚胎

圖D.5桑椹期胚胎

囊胚