實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)設(shè)計(jì)大綱實(shí)驗(yàn)名稱：課題來(lái)源：設(shè)計(jì)班級(jí)：設(shè)計(jì)人員：設(shè)計(jì)日期：指導(dǎo)老師：一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，存在的問(wèn)題，解決問(wèn)題的思路。目的與意義:比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點(diǎn),建立理想動(dòng)物模型,為研究發(fā)病機(jī)理和防治措施奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀：人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,RSV)是全球嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體,幾乎所有兒童兩歲前感染過(guò)至少一次RSV[1],年齡越小病情越重,再感染率高,與哮喘發(fā)生密切相關(guān)[2]。免疫缺陷者更易感染,臨床癥狀更為嚴(yán)重,常致死亡[3]。每年住院治療的50%-75%嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和25%~40%的肺炎是RSV直接引起,1歲內(nèi)嬰兒RSV感染率68.8%,1-2歲感染率達(dá)82.6%~100%。嬰兒期急性RSV下呼吸道感染使非特應(yīng)體質(zhì)和特應(yīng)體質(zhì)兒童發(fā)生哮喘危險(xiǎn)性都比普通兒童明顯增加,是哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]雖然已有許多抗RSV制劑和疫苗的研究,但尚無(wú)安全有效的防治方法?？筊SV制劑的研究需要建立理想的動(dòng)物模型,但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。肺組織RSV抗原保護(hù)性免疫僅能維持?jǐn)?shù)月,福爾馬林滅活疫苗不能起到保護(hù)作用反而加重病情,至今RSV仍無(wú)安全有效的治療藥物和預(yù)防疫苗,脫氧核酶等新型抗RSV制劑正在研究中,已在體外無(wú)細(xì)胞體系和細(xì)胞模型中表現(xiàn)抗病毒活性,需要建立恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型,進(jìn)一步在體內(nèi)研究其抗病毒作用[5]。從RSV發(fā)現(xiàn)至今,已建立的黑猩猩、獼猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有優(yōu)勢(shì)和局限[6],除靈長(zhǎng)類動(dòng)物可出現(xiàn)臨床癥狀,其他都是無(wú)癥狀隱性感染[7]。BALB/c小鼠為近交繁殖產(chǎn)生，其對(duì)多種病原體具有易感性，利用小鼠建立模型的優(yōu)點(diǎn)是它易獲得,遺傳背景清楚而均一,基因改造技術(shù)成熟,已有多種商品化試劑,是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但小鼠不是RSV自然宿主,我們以往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BALB/c鼠感染RSV沒(méi)有臨床癥狀,肺內(nèi)病毒復(fù)制水平相對(duì)低,病毒滴度下降快,帶毒時(shí)間短,限制了治療效果的觀察[8]。裸小鼠采用nu／+雌鼠與nu／nu雄鼠交配方法產(chǎn)生，這種無(wú)毛小鼠是由于第11號(hào)染色體等位基因突變引起的，裸小鼠主要特征是無(wú)毛、裸體和無(wú)胸腺，缺乏成熟T細(xì)胞的免疫功能，B淋巴細(xì)胞正常，成年裸小鼠較普通小鼠有較高水平的NK細(xì)胞活性，目前未做過(guò)裸小鼠RSV感染模型，對(duì)其優(yōu)勢(shì)和局限尚不完全清楚。存在的問(wèn)題：目前雖然已有許多抗RSV制劑和疫苗的研究,但尚無(wú)安全有效的防治方法，RSV感染具體發(fā)病機(jī)制也不夠清楚，其發(fā)病機(jī)制和抗RSV制劑的研究需要建立理想的動(dòng)物模型,但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。解決問(wèn)題的思路：復(fù)制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型，不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度,計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變，比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：[1]BlackCP.SystematicReviewoftheBiologyandMedicalManagementofRespiratorySyncytialVirusInfection[J].RespiratoryCare,2003;48(3):209-233.[2]HoltPC,S1yPD.InteractionsbetweenRSVinfection,asthmaandatopy:unravelingthecomplexities[J].JExpMed,2002;196(10):1271-1275.[3]MeissnerHC,RennelsMB,PickeringLK,etal.Riskofsevererespiratorysyncytialvirusdisease,identificationofhighriskinfantsandrecommendationsforprophylaxiswithpalivizumab[J].PediatrInfectDisJ,2004;23(3):284-285.[4]OddywH,deMerkNH,S1yPD,eta1.Theeffectsofrespiratoryinfections,atopyandbreastfeedingonchildhoodasthma[J].EurRespirJ,2002;19(5):899-905.[5]ZhaoC-A,ZhaoX-D,YuH-Getal.InhibitionofrespiratorysyncytialvirusreplicationinculturedcellsbyRNAcleavingDNAzyme[J].ChinJPediatr,2003;41(8):594-598.[6]SchmidtAC,JohnsonTR,PeterJM,etal.Respiratorysyncytialvirusandotherpneumoviruses:areviewoftheinternationalsymposium-RSV2003[J].VirusResearch,2004;106:1-13.[7]McArthur-VaughanK,GershwinLJ.Arhesusmonkeymodelofrespiratorysyncytialvirusinfection[J].JMedPrimatol,2002;31(2):61-73.[8]LianG-L,YuH-G,ZhaoX-D,etal.Establishmentofrespiratorysyncytialvirusinfectionmodelinmice[J].JXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences),2003;24(4):329-332.二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo),擬解決的主要問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)專業(yè)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，可行性分析,預(yù)期結(jié)果，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工作時(shí)間安排）。（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題設(shè)計(jì)目標(biāo)：比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點(diǎn),以建立理想動(dòng)物模型擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的復(fù)制，對(duì)試驗(yàn)性RSV感染的模型進(jìn)行分組與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)（遺傳背景，微生物質(zhì)量控制，育種繁殖，飼養(yǎng)管理，動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)技術(shù)）（1）遺傳背景BALB/c鼠遺傳背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遺傳背景：采用nu／+雌鼠與nu／nu雄鼠交配方法產(chǎn)生的同源導(dǎo)入近交系小鼠（2）微生物質(zhì)量控制BALB/c小鼠微生物質(zhì)量要求：普通級(jí)動(dòng)物要求。裸小鼠微生物質(zhì)量要求：SPF（無(wú)特定病原體）或無(wú)菌要求（3）飼養(yǎng)管理BALB/c小鼠飼養(yǎng)管理:BALB/c小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為18-19℃，相對(duì)濕度為40%-70%，每小時(shí)換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300BALB/c小鼠設(shè)施：開(kāi)放系統(tǒng)BALB/c小鼠籠器具：采用無(wú)毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無(wú)毒性、無(wú)異味、塵埃少的材料如電刨花，墊料須經(jīng)高壓蒸汽滅菌BALB/c小鼠飼喂：飼喂小鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，飼料的消毒滅菌應(yīng)達(dá)到相應(yīng)等級(jí)小鼠微生物控制的要求。飼喂采取“少量勤添”的原則，每周喂料3-4次，飲水應(yīng)保證連續(xù)不斷，每周換水2-3次，墊料每周更換1-2次BALB/c小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：做好室內(nèi)的清潔、消毒、及飼料籠器具的清洗消毒，每次飼養(yǎng)完后，用苯扎溴銨擦拭籠架、地板，每月定期徹底噴霧消毒1次裸小鼠飼養(yǎng)管理:裸小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度為18-19℃，相對(duì)濕度為40%-70%，每小時(shí)換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lx，空氣潔凈度為10裸小鼠設(shè)施：屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)裸小鼠籠器具：采用無(wú)毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無(wú)毒性、無(wú)異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經(jīng)過(guò)滅菌消毒裸小鼠飼喂：每周飼喂全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料2—3次。飼料、飲水、墊料及鼠籠均用雙層包布包裝高壓蒸汽滅菌消毒。進(jìn)室前經(jīng)緩沖室紫外燈照射后去除外層包布，才能進(jìn)入繁殖室及實(shí)驗(yàn)室裸小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：繁殖室設(shè)在空氣過(guò)濾十萬(wàn)級(jí)環(huán)境中放置層流柜作為裸小鼠繁殖飼養(yǎng)條件。啟用前，先用2％新潔而滅全面擦拭，然后按消毒區(qū)域的容積用高錳酸鉀15g，In2加福爾馬林15mL混和熏蒸。最后經(jīng)紫外燈照射，細(xì)菌培養(yǎng)陰性才使用。啟用后我們的常規(guī)消毒是：進(jìn)實(shí)驗(yàn)室前后紫外燈照射30rain，每2周用2％新潔而滅擦拭墻壁、天花板，每一個(gè)月用過(guò)氧乙酸噴射消毒。每三個(gè)月用甲醛和高錳酸甲熏蒸一次(用備用實(shí)驗(yàn)室輪流消毒和使用)。每三個(gè)月將層流柜的過(guò)濾材料拆下進(jìn)行清洗。每年更換一次過(guò)濾材料。飼養(yǎng)人員定期入繁殖室進(jìn)行飼養(yǎng)管理操作。進(jìn)室前需淋浴并用新潔而滅常規(guī)泡手、消毒、穿無(wú)菌衣、帶襪的無(wú)菌褲、戴口罩、帽子。外層穿上手術(shù)隔離衣，并帶手術(shù)膠手套及無(wú)菌紗手套。每次操作完畢，用新潔而滅抹臺(tái)面及地面。常規(guī)每周換兩次籠具，投放34d的飼料與飲水。每周加兩次雞蛋和瓜子及一次維生素。2、實(shí)驗(yàn)專業(yè)設(shè)計(jì)選用BALB/c鼠和裸小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，感染RSV后不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度,計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變3、實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩兩組間比較用t檢驗(yàn),各組間比較用方差分析。α=0.05,P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。4、實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線BALB/cBALB/c小鼠C：感染6天的C：感染6天的BALB/c小鼠B：感染3天的BALB/c小鼠A：對(duì)照BALB/c小鼠D：對(duì)照裸鼠裸小鼠F：感染6天的裸鼠E裸小鼠F：感染6天的裸鼠E：感染3天的裸鼠不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度不同時(shí)間空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織病毒滴度,計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測(cè)RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法（1）隨機(jī)抽樣：選正常成年健康體重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分別將30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按體重由小變大編號(hào)后，從隨機(jī)數(shù)字表中查取隨機(jī)數(shù)字，依次抄錄于小鼠編號(hào)下。具體方法：兩種動(dòng)物編號(hào)為1—30號(hào)，30只BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到A組，余1到B組，余2到C組；30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到D組，余1到E組，余2到F組（2）實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分六組：A：對(duì)照BALB/c小鼠B：感染3天的BALB/c小鼠C：感染6天的BALB/c小鼠D：對(duì)照裸鼠E：感染3天的裸鼠F：感染6天的裸鼠（3）模型復(fù)制:1.病毒和細(xì)胞培養(yǎng):Hep-2細(xì)胞接種RSV標(biāo)準(zhǔn)A2株病毒,含2%胎牛血清(FBS)DMEM培養(yǎng)至病變達(dá)90%~100%,吸取培養(yǎng)液,4℃,3000g離心10min收集上清,-802.病毒接種:BALB/c小鼠和無(wú)特殊病原菌(specificpathogenfree,SPF)級(jí)8～12周齡、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉0.06mg/g麻醉后,感染組鼻腔緩慢滴入2×106PFU/mlRSVA2株病毒液50μl,陰性對(duì)照組滴入50μl2%FBSDMEM。(4)取材:病毒分離和滴度分析:感染后不同時(shí)間處死小鼠,無(wú)菌條件下取左肺、肝臟和脾臟稱重,按10ml/g(wt/vol)加入預(yù)冷組織平衡液,勻漿制備肺臟、肝臟和脾臟組織懸液,4℃,2500g離心10min,取上清接種于Hep2細(xì)胞,2%FBS1640培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)(5)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定:1.空斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度:3×105/mlVero細(xì)胞接種至6孔板,10%FBS的1640培養(yǎng)至單層致密無(wú)孔細(xì)胞,接種10倍倍比稀釋的病毒液100μl,每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔,未感染病毒為對(duì)照孔。病毒吸附2h后覆蓋含1.5%的瓊脂糖凝膠和2%FBS的1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)5天,5mg/mlMTT顯色,計(jì)數(shù)空斑,計(jì)算病毒滴度:PFU/ml=稀釋度××P=該濃度下各孔空斑數(shù);n=復(fù)孔數(shù);v=每孔接種病毒液體積(ml)2.支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù):感染后第3天、6天和9天處死小鼠,氣管插管,預(yù)冷生理鹽水0.5ml灌洗2次,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。4℃,1000g離心10min,取細(xì)胞沉渣涂片,Wright染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞,3.直接免疫熒光實(shí)驗(yàn):取感染后第3天小鼠BALF離心細(xì)胞沉渣涂片,4℃丙酮固定干燥,按LightDiagnosticsRespiratorypanel1DFA免疫熒光試劑盒說(shuō)明書(shū)(Chemicon,USA)鑒定RSV抗原,4.肺組織病理學(xué)檢查:感染后第3天、6天處死小鼠,取未經(jīng)支氣管肺泡灌洗的右肺組織,一部分4%多聚甲醛固定,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。另一部分立即2.5%戊二醛固定,送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室包埋、制成超薄切片,透射電鏡檢查。5.免疫組織化學(xué)檢查:RSV抗原免疫組織化學(xué)染色SP染色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司),一抗是針對(duì)RSV整個(gè)病毒抗原的山羊多克隆抗體(USBiological,USA)。4%多聚甲醛固定肺組織,常規(guī)切片,各步操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,DAB顯色后顯微鏡下觀察。同一標(biāo)本未滴加一抗的切片作陰性對(duì)照。圖像分析采用北航真彩色病理圖像分析系統(tǒng)