細(xì)胞傳代培養(yǎng)

組織培養(yǎng)HeLa細(xì)胞傳代早期的組織培養(yǎng)

1885年，Roux用溫生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織，首次采用"Tissueculture"1903年，Jolly用蓋片懸滴法培養(yǎng)蠑螈白細(xì)胞1906年，Beebe蓋片懸滴培養(yǎng)狗淋巴細(xì)胞組織培養(yǎng)的建立

1907年，Harrison培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)成功，創(chuàng)建蓋片凹玻璃懸滴培養(yǎng)法，公認(rèn)為組織培養(yǎng)真正的開始1910年，Carrel完善懸滴培養(yǎng)法，將無菌技術(shù)應(yīng)用到組織培養(yǎng)中組織培養(yǎng)的進(jìn)展

1943年，Earle等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首建長期傳代的L-細(xì)胞系1948年，Sanford創(chuàng)建單細(xì)胞分離培養(yǎng)法，獲L-細(xì)胞純系1951年，Gey首建人腫瘤細(xì)胞——HeLa細(xì)胞系1961年，Hayflick首建人二倍體細(xì)胞系25種（hayflick界限）組織培養(yǎng)發(fā)展概況我國組織培養(yǎng)的發(fā)展

30年代傳入、50年代建立實(shí)驗(yàn)室60年代我國建立世上第一個(gè)肝癌細(xì)胞系(BEL16)1985年成立了中國典型培養(yǎng)物保藏中心1990年中科院建立了細(xì)胞庫附：組織培養(yǎng)在植物學(xué)界

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt就預(yù)言植物細(xì)胞的全能性1934年，荷蘭植物學(xué)家溫特發(fā)現(xiàn)生長素，并證實(shí)了對植物細(xì)胞培養(yǎng)的作用1937年，普林斯頓的White等實(shí)驗(yàn)室獲得植物培養(yǎng)物的愈傷組織并長期培養(yǎng)成功。這是植物細(xì)胞與組織的首次成功1958年，Steward在人工條件下用胡蘿卜根部的細(xì)胞培育出了新植株優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用組織培養(yǎng)發(fā)展概況組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)、傳代細(xì)胞系、細(xì)胞株、克隆懸浮型、貼附型上皮細(xì)胞型細(xì)胞成纖維細(xì)胞型細(xì)胞游走型細(xì)胞不規(guī)則型細(xì)胞生存條件

基本營養(yǎng)物質(zhì)生長刺激因子水溫度氣體和氫離子濃度無菌的環(huán)境（無菌操作）其它（濕度、光等）

無菌操作環(huán)境的滅菌器械、器皿的清洗與滅菌無菌操作操作前要洗手，并用75%酒精噴手。試劑瓶等也要以酒精擦試。點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品可在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長，并冷卻后才能使用，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。主要儀器設(shè)備超凈工作臺培養(yǎng)用液的配制、滅菌與保存（一）平衡鹽緩沖液

磷酸鹽緩沖液（PBS液，無Ca2+、Mg2+離子）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4，溶于800mL去離子水中，用鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至7.4，然后定容至1L。過濾后121oC滅菌20min，4oC保存

培養(yǎng)基

主要成分（天然）：血清、血漿、胚胎浸出液、水解乳蛋白等。

主要成分（合成）：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、輔助物質(zhì)(核酸降解物、氧化還原劑等)。如：RPMI1640、DMEM、HamF12和Mc-Coy5A以超純水配制；過濾除菌、4oC保存。工作液含有10％FBS、1%雙抗抗生素

為防止微生物污染，培養(yǎng)基需加入青霉素、鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素等。常用的是青霉素和鏈霉素的混合液。終濃度：青霉素10000U/mL、鏈霉素10000ug/mL培養(yǎng)用液的配制、滅菌與保存（二）消化液胰蛋白酶溶液胰酶溶液在pH8.0，溫度37℃，作用能力最強(qiáng)。注意：鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力。胰酶溶液常用PBS或者無鈣、鎂離子的D-Hanks平衡鹽溶液配制成0.25%溶液。EDTA·Na2溶液化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離觧作用，而且毒性小。常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，一定要用PBS沖洗干凈，殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長。pH調(diào)整液NaHCO3

溶液

常用濃度5.6%。pH值超過后，可用高壓滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體方法調(diào)節(jié)。HEPES（N-2-羥乙基派嗪-N‘-2-乙黃酸）溶液

氫離子緩沖劑，具有較強(qiáng)的緩沖能力，能夠較長時(shí)間維持其緩沖作用。培養(yǎng)細(xì)胞的檢測常規(guī)檢查細(xì)胞生長狀況培養(yǎng)液污染生物學(xué)檢測形態(tài)：一般形態(tài)觀察、超微結(jié)構(gòu)觀察、細(xì)胞骨架觀察生長特性：細(xì)胞生長曲線等細(xì)胞遺傳：DNA染色，DNA含量測定，染色體的核型分析

細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡性程度

細(xì)胞的密度細(xì)菌污染pH值變化對細(xì)胞的影響原代培養(yǎng)期傳代期衰退期潛伏期（貼附期）對數(shù)生長期平臺期衰退期細(xì)胞培養(yǎng)周期HeLa細(xì)胞傳代材料：HeLa細(xì)胞系美國霍普金斯大學(xué)GeorgeGey、MargaretGey等人，1951年來源：人宮頸癌細(xì)胞貼壁生長（能懸浮生長）形態(tài)：上皮細(xì)胞型

PBS

DMEM培養(yǎng)基

雙抗（100X）

消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%

EDTA溶液

試劑鏡檢，觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)吸棄培養(yǎng)基，加入1mlPBS溶液洗去殘余培養(yǎng)基向培養(yǎng)皿內(nèi)滴加200ml消化液，37oC消化2-3min加500ml含10％血清的DMEM培養(yǎng)基（終止消化、懸浮細(xì)胞）

【細(xì)胞計(jì)數(shù)：取20ml細(xì)胞懸液以PBS稀釋后計(jì)數(shù)】按比例分兩盤，進(jìn)行傳代。觀察：細(xì)胞分散均勻；密度：一約30%、一約60%。37oC、5％CO2培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長周期實(shí)驗(yàn)步驟35mm平皿較淺，加液后移動時(shí)請拿穩(wěn)，避免晃動；加消化液時(shí)，請均勻地滴加在皿底；消化時(shí)間不宜過久，以免影響細(xì)胞活性；可通過鏡檢確定是否終止消化；除加消化液時(shí)，其他加液時(shí)避免直接沖擊細(xì)胞；操作時(shí)，勿使皿蓋打開過久；勿使細(xì)胞長期處于干燥狀態(tài)；分盤后，將皿沿水平方向前后、左右各輕輕晃動幾次，使細(xì)胞分散均勻。注意事項(xiàng)鏡檢，觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)吸棄培養(yǎng)基加入1.5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，加入150

l含有H2O2的完全培養(yǎng)基，至終濃度為0.8mm