《畜禽魏氏梭菌病診斷技術(shù)規(guī)范》VIP

畜禽魏氏梭菌病診斷技術(shù)規(guī)范?????范圍本文件規(guī)定了畜禽魏氏梭菌病診斷的術(shù)語和定義、臨床診斷、病原菌的分離培養(yǎng)、病原菌的鑒定與結(jié)果判定、生物安全。本文件適用于畜禽魏氏梭菌病的診斷、檢疫、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求NY/T3073家畜魏氏梭菌病診斷技術(shù)NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T2754.10出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法第10部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌SN/T2979兔魏氏梭菌病檢疫技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。魏氏梭菌（Clostridiumwelchii）又稱產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens），一種厭氧的革蘭氏陽性梭狀桿菌，有莢膜、有芽孢、無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)，廣泛存在于土壤、水體、飼料、糞便和動(dòng)物腸道中，可感染牛、羊、豬、兔、雞、鴨、鵝等多種畜禽及野生毛皮動(dòng)物。血清型（Serotype）魏氏梭菌主要產(chǎn)生α、β、ε和ι四種致病性外毒素，根據(jù)毒素的產(chǎn)生情況可將該菌分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）五種血清型。魏氏梭菌?。–lostridiumwelchiidisease）牛魏氏梭菌病又稱牛猝死癥，由A型魏氏梭菌引起的牛的急性傳染病，發(fā)病率低，致死率極高，以突然死亡、實(shí)質(zhì)器官以及消化道大量出血為特征。羊魏氏梭菌病由魏氏梭菌引起的羊的傳染性疾病，發(fā)病急、病程短、病死率高，包括羔羊痢疾（B型魏氏梭菌）、羊腸毒血癥（D型魏氏梭菌）、羊猝狙（C型魏氏梭菌）和羊黑疫（B型魏氏梭菌）。豬魏氏梭菌病又稱豬梭菌性腸炎、豬傳染性壞死性腸炎、仔豬腸毒血癥（俗稱仔豬紅?。怯葾型或C型魏氏梭菌感染豬引起的一種急性消化道傳染病。兔魏氏梭菌病又稱兔梭菌性腸炎，主要由A型或E型魏氏梭菌引起的一種腸毒血癥。禽魏氏梭菌病主要由A型或C型魏氏梭菌感染禽類引起的一種以壞死性腸炎為特征的急性傳染病。臨床診斷牛魏氏梭菌病牛魏氏梭菌病的臨床診斷參照NY/T3073的規(guī)定執(zhí)行。羊魏氏梭菌病羔羊痢疾4.2.1.1流行病學(xué)1月齡內(nèi)羊羔易感，多由母羊營養(yǎng)不良、產(chǎn)羔季節(jié)寒冷或炎熱誘發(fā)。4.2.1.2臨床癥狀呈急性或亞急性經(jīng)過。初期發(fā)熱，精神沉郁，食欲減退或廢絕，低頭弓背，喜伏臥，頭頸向后彎曲。隨后持續(xù)性腹瀉，排黃色或帶血稀便。后期大便失禁，極度脫水后死亡。4.2.1.3病理變化胃內(nèi)有凝乳塊。實(shí)質(zhì)器官腫大、變性。小腸呈出血性腸炎變化，黏膜上有潰瘍斑。羊腸毒血癥4.2.2.1流行病學(xué)2~12月齡羊在春夏或秋冬換季時(shí)易感。4.2.2.2臨床癥狀突然死亡或出現(xiàn)癥狀后2~4h死亡。哀鳴，呼吸急促，倒地抽搐，角弓反張，眼結(jié)膜和口黏膜蒼白，有濃稠膠凍狀的黃色鼻液，排黃褐色水樣稀糞，腹部通常不發(fā)生臌氣。4.2.2.3病理變化心外膜有出血點(diǎn)。腎臟充血、腫脹、軟化。小腸黏膜充血、出血，腸壁有潰瘍斑。羊猝狙4.2.3.1流行病學(xué)6~24月齡羊易感，低洼沼澤地區(qū)多發(fā)，呈地方流行性。4.2.3.2臨床癥狀發(fā)病急，3~6h內(nèi)死亡。病羊突然沉郁，劇烈痙攣，倒地咬牙，眼球突出，驚厥而亡。4.2.3.3病理變化小腸呈出血性腸炎變化，空腸潰瘍或糜爛。腎臟腫大，但質(zhì)不軟。死亡8h后骨骼肌中呈現(xiàn)氣腫疽樣病變。羊黑疫4.2.4.1流行病學(xué)2~4歲、營養(yǎng)狀況較好的膘肥羊易感，潮濕低洼的沼澤地草場(chǎng)多發(fā)，夏秋季節(jié)多發(fā)。4.2.4.2臨床癥狀突然死亡。少數(shù)病程持續(xù)1~3天，食欲不振，反芻停止，發(fā)熱，呼吸急促，口鼻含淡黃色液體，俯臥在地，昏睡狀態(tài)下死亡。4.2.4.3病理變化皮下靜脈淤血，胸部皮下組織水腫。心內(nèi)膜有出血點(diǎn)，心包積液。腹腔積液，呈黃色，在空氣中暴露后凝固。肝臟腫大、充血，有灰黃色壞死灶，呈不規(guī)則的圓形。小腸黏膜和真胃幽門充血、出血。豬魏氏梭菌病豬魏氏梭菌病的臨床診斷參照NY/T3073的規(guī)定執(zhí)行。兔魏氏梭菌病兔魏氏梭菌病的臨床診斷參照SN/T2979的規(guī)定執(zhí)行。禽魏氏梭菌病流行病學(xué)無明顯流行季節(jié)，各品種和各年齡段的禽類均易感，2周齡~6月齡多發(fā)。傳播途徑以消化道為主。該病通常與多種應(yīng)激因素協(xié)同發(fā)生，如球蟲感染、飼料中淀粉和蛋白質(zhì)含量過高、飼料變質(zhì)、低溫等。臨床癥狀病禽精神沉郁，采食量下降，眼瞼腫大，羽毛蓬松雜亂，排黃色粥樣稀糞。隨病程發(fā)展，排出紅色或煤焦油狀的惡臭味糞便，混有血塊和組織碎片，迅速消瘦，急性死亡。病理變化腸道表面呈烏黑色，小腸后段腸管擴(kuò)張，充滿氣體。剪開可見黑褐色腸容物，腸黏膜壞死、脫落、有出血點(diǎn)，表面覆有棕褐色或黃色麩皮樣物質(zhì)。結(jié)果判定如動(dòng)物表現(xiàn)出上述典型的臨床癥狀和病理變化，結(jié)合流行病學(xué)，可判定為魏氏梭菌病疑似病例。病原菌的分離培養(yǎng)樣品的采集、保存與運(yùn)輸病畜禽組織、腸內(nèi)容物、糞便等病料樣品的采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541的要求執(zhí)行。細(xì)菌分離培養(yǎng)接種無菌條件下進(jìn)行。腸內(nèi)容物和糞便用1mL生理鹽水稀釋，接種至血瓊脂平板和胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（TSC）平板。平板的配制按照GB4789.28的規(guī)定進(jìn)行。組織經(jīng)表面消毒后可直接用于細(xì)菌分離。培養(yǎng)接種后的平板在45℃、厭氧環(huán)境（含5%CO2的厭氧培養(yǎng)箱、燭缸或含厭氧產(chǎn)氣包的厭氧培養(yǎng)缸）中倒置培養(yǎng)12h。菌落形態(tài)觀察與結(jié)果判定菌落在血瓊脂平板上呈圓形、直徑2~5mm、有雙溶血環(huán)，在TSC平板上有黑色中心，可判定為魏氏梭菌疑似菌落。病原菌的鑒定與結(jié)果判定生化鑒定與結(jié)果判定生長試驗(yàn)按照SN/T2979中規(guī)定的方法，挑取疑似菌落，用厭氧肉肝湯和牛乳培養(yǎng)基進(jìn)行生長試驗(yàn)。生化鑒定按照NY/T3073的規(guī)定進(jìn)行生化試驗(yàn)。結(jié)果判定厭氧肉肝湯中培養(yǎng)后渾濁，產(chǎn)生大量氣泡；牛乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)后呈現(xiàn)“爆裂發(fā)酵”，牛乳變成多孔的海綿狀凝塊；并且疑似菌落的生化特性符合NY/T3073的要求，可確認(rèn)該菌為魏氏梭菌。16SrRNA基因的PCR檢測(cè)方法與結(jié)果判定PCR檢測(cè)引物針對(duì)魏氏梭菌的16SrRNA基因（GenBank登錄號(hào)：NR_121697）設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)引物。上游引物序列：5?-TAACCTGCCTCATAGAGT-3?；下游引物序列：5?-TTTCACATCCCACTTAATC-3?。擴(kuò)增片段大小為481bp。樣品制備與反應(yīng)體系配置被檢樣品的制備、核酸抽提和反應(yīng)體系的配置按照SN/T2979的規(guī)定操作。魏氏梭菌參考菌株（ATCC13124）的基因組作為陽性對(duì)照，無菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。電泳配制1.5%的瓊脂糖凝膠，添加工作濃度的核酸染料。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時(shí)用DNAMarker作為分子量參考。用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。結(jié)果判定陽性對(duì)照擴(kuò)增出481bp的條帶，同時(shí)陰性對(duì)照未見有PCR擴(kuò)增條帶，檢測(cè)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陽性，可確認(rèn)為魏氏梭菌；被檢樣品未出現(xiàn)與陽性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陰性。16SrRNA基因的LAMP檢測(cè)方法與結(jié)果判定