DB21-T 3256-2020非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測技術(shù)規(guī)范

ICS11.220

B41

備案號：71442-2020DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3256—2020

非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法

Loop-mediatedIsothermalAmplification（LAMP）forRapidDetectionforAfrican

SwineFeverVirus

DB21/T3256—2020

非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟病毒等溫擴增快速檢測方法的技術(shù)要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于非洲豬瘟疫病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于豬血液、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟等

組織樣品中非洲豬瘟病毒核酸的快速檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB19489實驗室生物安全通用要求

3原理

非洲豬瘟病毒是一種DNA病毒，該檢測方法利用6條特異性引物和具有鏈置換能力的DNA聚合酶，在

等溫環(huán)境下1h內(nèi)完成擴增，用于非洲豬瘟病毒的核酸檢測。

4儀器和器材

4.1高速臺式冷凍離心機（離心范圍0～20000r/min）

4.2冰箱：4℃±1℃冰箱，-20℃±1℃冰箱，-7℃±1℃冰箱

4.3恒溫LAMP擴增儀（型號：Gene-8C）

4.4離心管：15ml離心管、1.5ml離心管和0.2mlPCR專用離心管

4.5微量移液器：1000μl，200μl，100μl，50μl，20μl，10μl，2μl

5試劑和引物

5.1樣品處理劑

5.2ASFV-R-Mix

5.3Bstenzyme

5.4D-I礦物油

5.5陽性對照

5.6陰性對照

注：本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含DNA或DNase的分析純或生化試劑；

所有試劑均用無菌的容器分裝。

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DB21/T3256—2020

6操作步驟

6.1樣品的采集、前處理、存放與運輸

6.1.1采樣注意事項

采集樣品及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。

6.1.2采樣工具

15ml離心管和1.5ml離心管經(jīng)121±1℃高壓滅菌20min；剪刀、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h，無

菌管（真空采血管）。

6.1.3組織病料的采集與前處理

采集疑似非洲豬瘟病毒感染豬的肺臟、肝臟、腎臟、脾臟等組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待

檢樣品約10g于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入0.3ml～0.5ml組織懸液混勻，60℃，30min

滅活后，將懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，4℃條件下5000r/min離心10min，編號備用。

6.1.4全血及血清樣本的采集與前處理

使用含有抗凝血劑（EDTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從耳靜脈或前腔靜脈采集血液3ml～5

ml，60℃，30min滅活后，可直接檢測；若檢測血清，可靜置全血樣本待血清析出后，直接吸取至無

菌Eppendorf管中，60℃，30min滅活后，編號備用。

6.1.5存放與運輸

采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)

避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在8h之內(nèi)運送

到實驗室檢測。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標(biāo)識。

6.2樣品DNA的提取

取10μl前處理過的樣本加入無菌1.5ml離心管，加入10μl樣品處理劑，混勻，94℃裂解2min，

瞬時離心，上清即為擴增模板。

6.3核酸擴增

6.3.1吸取22μlASFV-R-Mix和1μlBstenzyme加入同一個PCR管，吸取2μl步驟6.2處理的

核酸擴增模板加至PCR管，混勻，設(shè)置陰陽性對照；

6.3.2吸取10μlD-I礦物油輕輕加至PCR管液面，切勿震蕩混勻；

6.3.3插入到恒溫擴增儀反應(yīng)槽中；

6.3.4設(shè)置恒溫擴增儀器反應(yīng)條件為：65℃反應(yīng)12min，熒光采集周期20s。

7試驗成立條件與結(jié)果判定

7.1試驗成立條件

使用前用陰、陽性對照進行該檢測方法評價，若陽性對照CT值≤40，陰性對照CT值＞40，則檢測結(jié)

果有效。

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DB21/T3256—2020

7.2結(jié)果判定

若CT值≤40，樣品應(yīng)判定為非洲豬瘟病毒核酸陽性；若CT值＞40，樣品應(yīng)判定為非洲豬瘟病毒核酸

陰性

8實驗室生物安全要求

按照GB19489實驗室生物安全通用要求執(zhí)行。

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

試劑配制

A.1樣品處理劑的制備

量取80mlPBS（0.01mol/L，pH值7.4），加入10μlNP40（乙基苯基聚乙二醇），無菌純化水

定容至100ml，定量分裝，500μl/管，-20℃保存。

A.2ASFV-R-Mix的制備

A.2.1引物合成

根據(jù)非洲豬瘟病毒p72基因片段的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計3對引物，包括1對內(nèi)引物（FIP與BIP）、1對外引

物（F3與B3）和1對環(huán)引物（LF與LB），均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列為：

FIP：5'-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3'

BIP：5'-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3'

F3：5'-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3'

B3：5'-CCAACAATAACCGCCACGC-3'

LF：5'-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3'

LB：5'-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3'

A.2.2引物混合物的制備

取3對引物（FIP、BIP、F3、B3、LF和LB）干粉，按引物說明書分別加入適量無菌純化水，溶解混

勻，得到各引物溶液，置-20℃保存。

A.2.3ASFV-R-Mix的配制

稱取2.4gTris，0.37g氯化鉀，0.12g硫酸鎂，100μl吐溫-20，7.029g甜菜堿，溶于80ml

純化水，依次加入終濃度為1.4mmol/LdNTPs溶液、0.2μmol/L外引物溶液、1.6μmol/L內(nèi)引物溶液、

0.8μmol/L環(huán)引物溶液，加入無菌純化水定容至100ml，經(jīng)過0.22μm濾器過濾除菌，分裝至2ml藍(lán)

蓋可立凍存管中，1.1ml/管，-20℃保存。

A.3Bstenzyme的制備

用于制備本試劑盒的Bstenzyme為商品化DNA聚合酶，按使用說明書用純化水稀釋至4×106/L，分

裝至0.5ml白蓋可立凍存管中，100/μl管，-20℃保存。

A.4D-I礦物油

用于制備本試劑盒的D-I礦物油為商品化礦物油，分裝至2ml黃蓋可立凍存管中，500μl/管，

-20℃保存。

A.5陽性對照

采用核酸蛋白質(zhì)分析儀測定陽性質(zhì)控品濃度，計算質(zhì)粒拷貝數(shù)，用純化水將其稀釋為103拷貝/μl，

分裝至0.5ml紅蓋可立凍存管中，100μl/管，-20℃保存。

A.6陰性對照

取純化水，分裝至0.5ml綠蓋可立凍存管中，100μl/管，-20℃保存。

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DB21/XXXXX—XXXX

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心、中國科學(xué)院微生物研究所、洛陽萊普生信息科技有限

公司、遼寧佰瑞生物科技有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊作豐、周晨陽、李秀梅、王宏燕、楊利敏、董娜、劉文軍、張皓淳、姚偉、

劉洋、劉近、吳洪濤、任雪建、趙培、李蓉、章春燕、呂園園、陳騰。

本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，

我們將及時答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復(fù)審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號），聯(lián)系電話

標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省動物及產(chǎn)品檢疫中心（沈陽市沈河區(qū)萬柳塘路105號甲），聯(lián)系電

話

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