骨骼肌興奮與收縮實驗3

實驗1骨骼肌興奮與收縮實驗梅汝煥E-mail:rhmei@醫(yī)學(xué)院機能中心實驗成績評定方法本次實驗總分：10分預(yù)習(xí)、課堂討論、回答問題 2分實驗態(tài)度、實驗操作、實驗完成質(zhì)量 4分實驗報告 4分格式、方法、結(jié)果表述 2分討論 2分實驗成績評定方法學(xué)生曠課，記0分學(xué)生請假，須補做實驗，沒有補做實驗，報告不計分課堂上不動手操作，實驗操作部分扣4分；因操作者原因，導(dǎo)致實驗完全失敗，實驗操作部分扣4分報告遲交，7日內(nèi)，實驗報告部分扣2分，超過7天，實驗報告部分扣3分。學(xué)生不交實驗報告，扣4分實驗報告要求按照《浙江大學(xué)學(xué)報-醫(yī)學(xué)版》投稿要求撰寫實驗報告結(jié)果要用圖或表說明討論要深入要用一定數(shù)量的參考文獻（非教材）單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院2011級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2B班采用word2003撰寫，文件后綴為.doc文件名：實驗序號-實驗班級-姓名.doc（如：實驗1-2B班-張三.doc）交給組長，匯總后交給班長，班長交給任課教師:rhmei@課堂安排講解：實驗方法和觀察項目，其中穿插檢查評講演示：標本制備、肌肉收縮曲線引導(dǎo)、數(shù)據(jù)測量同學(xué)自己實驗數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計討論：對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果的分析與機制探討目的（Objective）學(xué)習(xí)蟾蜍坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本制備方法、微機生物信號采集處理系統(tǒng)的使用方法。探究刺激蟾蜍坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮的影響，分析刺激強度、刺激頻率與骨骼肌收縮張力的關(guān)系。探究神經(jīng)、骨骼肌興奮的電變化與肌收縮的關(guān)系。這兩只蟾蜍哪一只是雄？有哪些特征可以鑒別出蟾蜍的雌雄？1.材料和方法(Materialsandmethods)1.1實驗動物（laboratoryanimal)蟾蜍（中華蟾蜍指名亞種，ZhuoshanToad）♂蟾蜍皮膚光滑，前肢趾上有黑色、粗糙的斑塊（婚墊）,會鳴叫；♀蟾蜍皮膚粗糙，無婚墊，不會鳴叫。蟾蜍屬兩棲動物，其一些基本生命活動與哺乳動物近似，其離體組織和器官所需的生理環(huán)境比較簡單(無須供氧和恒溫)。蟾蜍常用于神經(jīng)生理、肌肉生理、心臟生理，微循環(huán)、水腫等實驗。1.2藥品任氏液(Ringer`ssolution)和20%高滲甘油任氏液英國生理學(xué)家林格(SydneyRinger，1835～1910)發(fā)明由無機鹽和蒸餾水配置而成，每升溶液含NaCl6.5g、KCl0.14g、CaCl20.12g,、NaHCO30.20g、NaH2PO40.01g用于兩棲類動物組織器官潤濕和營養(yǎng)。任氏液是模仿蟾蜍的什么成分配制？1.3器材(experimentalinstallation)RM6240生物信號處理系統(tǒng)(RM6240biolgicalsignalcollectingsystem)（成都儀器廠）、神經(jīng)肌肉標本盒（nerve-musclechamber)。RM6240C生物信號處理系統(tǒng)RM6240生物信號處理系統(tǒng)可以同時采集、放大、顯示、記錄、分析四路生物信號及一路刺激輸出，12導(dǎo)聯(lián)心電圖輸入記錄，可用于人體和動物實驗。儀器參數(shù)全程控設(shè)置，有多種數(shù)據(jù)分析功能和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換輸出功能。

神經(jīng)肌肉標本盒。探針(metalprobe)鋅銅弓(bimetalelectrode)玻璃分針(glassdissectingtool)張力換能器鋅銅弓有何作用？實驗解決問題的常用方法提出問題（做什么？）對問題提出假設(shè)驗證問題（怎么做？）設(shè)計實驗執(zhí)行實驗統(tǒng)計結(jié)果分析結(jié)果得出結(jié)論（做什么？）（怎么做？）實驗研究一般要經(jīng)歷哪些過程？4.甘油對骨骼肌收縮張力有何影響1.不同刺激強度對骨骼肌收縮張力的影響

不同刺激強度與肌肉收縮的關(guān)系？閾強度（閾刺激）和最大刺激？提出問題（做什么？）2.不同刺激頻率對骨骼肌收縮張力的影響不同刺激頻率刺激與骨骼肌收縮的關(guān)系？甘油浸泡后，骨骼肌收縮張力？作用部位？3.不應(yīng)期對骨骼肌收縮張力的影響不應(yīng)期與骨骼肌收縮張力的關(guān)系？骨骼肌收縮張力是否隨刺激強度增加而相應(yīng)增大？多大強度刺激可以產(chǎn)生閾強度（閾刺激）和最大刺激？4.甘油對骨骼肌收縮張力有何影響1.不同刺激強度對骨骼肌收縮張力的影響

對問題提出假設(shè)2.不同刺激頻率對骨骼肌收縮張力的影響最大刺激時，骨骼肌收縮張力是否隨刺激頻率增加而相應(yīng)增大？最大刺激時，隨刺激頻率的增加肌肉的收縮形式是否會發(fā)生改變？甘油能否降低骨骼肌收縮張力？甘油降低骨骼肌收縮的作用位是在：點神經(jīng)干動作電位、突觸傳遞、骨骼肌動作電位、興奮-收縮偶聯(lián)、收縮過程？3.不應(yīng)期對骨骼肌收縮張力的影響不應(yīng)期能否降低骨骼肌收縮張力？1.不同刺激強度對骨骼肌收縮張力的影響

驗證問題（怎么做？）實驗設(shè)計：實驗裝置模型坐骨神經(jīng)干腓腸肌裝置模型實驗分組（干預(yù)措施）對照組—自身前后對照不同刺激強度處理組觀察項目骨骼肌收縮張力2.不同刺激頻率對骨骼肌收縮張力的影響

實驗設(shè)計：實驗裝置模型坐骨神經(jīng)干腓腸肌裝置模型實驗分組（干預(yù)措施）對照組—自身前后對照不同刺激頻率處理組觀察項目骨骼肌收縮張力、收縮形式3.不應(yīng)期和甘油對骨骼肌收縮張力有何影響實驗設(shè)計：實驗裝置模型坐骨神經(jīng)干腓腸肌模型實驗分組（干預(yù)措施）對照組甘油處理組不同波間隔的雙刺激觀察項目神經(jīng)干動作電位（幅度、時程）骨骼肌肌膜動作電位（幅度、時程）骨骼肌收縮張力（收縮幅度、收縮時程、舒張幅度、舒張時程）分析結(jié)果使用甘油前后神經(jīng)干動作電位有無變化？骨骼肌肌膜動作電位有無變化？骨骼肌收縮張力有無變化？對照假設(shè)，以上結(jié)果說明什么問題？設(shè)計及操作有無需改進之處？可否設(shè)計更進一步的研究進行驗證？無變化無變化消失1.4實驗裝置模型的建立坐骨神經(jīng)干-腓腸肌收縮模型實驗動物：蟾蜍刺激坐骨神經(jīng)干引起腓腸肌收縮刺激：電刺激，可控記錄：信號采集系統(tǒng)，可分析刺激輸出記錄1.4.1儀器連接和參數(shù)(apparatusjunctionandparameter)檢查實驗裝置連接：神經(jīng)肌肉標本盒1對引導(dǎo)電極接微機生物信號處理系統(tǒng)3通道，換能器接第1通道。調(diào)節(jié)一維微調(diào)，使換能器處于適當高度并在微調(diào)可調(diào)節(jié)的最低位置。一維微調(diào)調(diào)節(jié)螺絲RM6240C微機生物信號處理系統(tǒng)換能器的固定調(diào)節(jié)裝置1.4.2在體坐骨神經(jīng)腓腸肌標本制備

蟾蜍毀腦脊髓坐骨神經(jīng)干-腓腸肌標本的在體分離術(shù)坐骨神經(jīng)干-腓腸肌標本制備1.4.3坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的放置和連接坐骨神經(jīng)腓腸肌的股骨插入固定孔固定，神經(jīng)干放置在標本盒的電極上，神經(jīng)與電極接觸良好。神經(jīng)干坐骨神經(jīng)腓腸肌標本的放置和連接實驗項目（執(zhí)行實驗）檢查評講探究問題一2.觀察（Observations)2.1刺激強度對肌肉收縮張力的影響跟腱結(jié)扎線垂直固定在換能器的懸臂梁上用一維微調(diào)旋鈕調(diào)節(jié)跟腱結(jié)扎線的緊張度，即調(diào)節(jié)前負荷為2.5+0.5g使用一個中等刺激（1v），檢查確定標本、儀器是否工作正常請判斷圖中記錄曲線的閾刺激（閾強度）、最大刺激在哪里？試述閾刺激（閾強度）、最大刺激的含義。閾刺激最大刺激手工記錄閾刺激、最大刺激的刺激強度保存數(shù)據(jù)文件點【停止記錄】菜單按鈕→文件→另存為…注意：數(shù)據(jù)不能存在“C盤”。2.2最大刺激時，不同刺激頻率刺激坐骨神經(jīng)對骨骼肌收縮張力的影響請指出圖中單收縮和不完全強直收縮的交界點，并說明產(chǎn)生不完全強直收縮的原因。2Hz18Hztwitchincomplete

tetanuscomplete

tetanus保存數(shù)據(jù)文件點【停止記錄】菜單→文件→另存為…注意：數(shù)據(jù)不能存在“C盤”。2.3觀察甘油對骨骼肌收縮的影響2.3.1觀察不應(yīng)期對肌肉收縮的影響abc張力換能器腓腸肌固定螺釘引導(dǎo)電極股骨坐骨神經(jīng)坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本打開配置：“實驗”——“骨骼肌興奮與收縮”刺激模式：“雙刺激”，最大刺激強度記錄波間隔為0.1,0.5,1,10,100,1000ms時的神經(jīng)干動作電位骨骼肌動作電位骨骼肌收縮張力同步觸發(fā)前一定要打√2.3.2甘油對骨骼肌收縮的影響配置文件：同“不應(yīng)期對肌肉收縮的影響”模型裝置：在“不應(yīng)期對肌肉收縮的影響”基礎(chǔ)上，用棉花包裹腓腸肌，于肌腱處滴加20%甘油高滲任氏液1-2滴，同時注意濕潤神經(jīng)干采用最大刺激（同步觸發(fā)），記錄神經(jīng)干動作電位骨骼肌動作電位骨骼肌收縮張力每隔3分鐘刺激一次，直至骨骼肌收縮消失記錄出現(xiàn)有AP無肌肉收縮的時間注意保存實驗數(shù)據(jù)2.4實驗數(shù)據(jù)的測量分析2.4.1不同刺激強度和頻率對骨骼肌收縮張力的影響2.4.2不應(yīng)期和甘油對骨骼肌收縮張力的影響神經(jīng)干動作電位幅度時程骨骼肌肌膜動作電位幅度時程骨骼肌收縮張力幅度收縮時程時程幅度收縮時程幅度2.4.3測量最大刺激時，肌肉收縮的潛伏期、收縮期時間和舒張期時間latentperiodcontractionphasesrelaxationphases2.4.3測量實驗數(shù)據(jù)匯總電腦桌面↓lab2-00↓打開實驗數(shù)據(jù)表↓在相應(yīng)組別中填入實驗數(shù)據(jù)↓保存3.1不同刺激強度刺激坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮張力的影響刺激波寬0.1ms的單刺激，閾刺激強度為

Uth±sV，最大刺激強度為

Umax±sV，閾強度刺激時的肌肉收縮力

x1±s(g)]顯著低于最大刺激強度刺激時的肌肉收縮力

x2±s(g)，兩者有顯性差異（p<0.05)，見表1

樣本閾強度最大刺激強度強度（V）收縮張力（g）強度（V）收縮張力（g）123456x±s表1.不同強度刺激對蟾蜍腓腸肌收縮張力的影響注：*p﹤0.05、**p﹤0.01vs閾刺激組3.結(jié)果（results)

T（g)U(V)MaximalstimulusThreshold

stimulus3.2刺激強度（U）與肌肉收縮張力（T）的關(guān)系在閾刺激強度與最大刺激強度之間，腓腸肌的收縮力隨著刺激強度的增大而增大，刺激強度大于最大刺激強度，腓腸肌的收縮力不再增大，見圖1、圖2。Fig.1forcevsstimulusvoltagebehavior張力（g）閾刺激最大刺激5g0圖.1刺激強度與肌肉收縮張力的關(guān)系曲線刺激強度（V）0.50.70.93.3不同頻率刺激刺激坐骨神經(jīng)對腓腸肌收縮張力的影響刺激波寬0.1ms，最大刺激強度時，單收縮的刺激頻率為

Ft±sHz，不完全強直收縮的刺激頻率為

Ficts±sHz

至

Ficte±sHz

、完全強直收縮的刺激頻率為

Fcts±sHz

至

Fcte±sHz

。不完全強直最大收縮力

Tict±s(g)和完全強直最大收縮力

Tct±s(g)顯著高于單收縮的最大收縮力為

Tt±s(g)（p<0.05），見表2

樣本單收縮不完全強直收縮完全強直收縮頻率（Hz）張力（g）頻率（Hz）張力（g）頻率（Hz）張力（g）12345678910x±s注：*p﹤0.05、**p﹤0.01vs單收縮組表2.頻率刺激對腓腸肌收縮張力的影響

T（g)F(Hz)completetetanusincomplete

tetanusFig.2forcevsstimulusfrequencybehavior

3.4收縮張力與刺激頻率的關(guān)系最大刺激時，隨著頻率刺激的逐漸增大，腓腸肌的收縮力不斷增加，到完全強直收縮后，再增加刺激頻率，腓腸肌的收縮力增大趨緩，見圖23.5不應(yīng)期、甘油對骨骼肌收縮的影響根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，參照“不同強度和頻率對肌肉收縮的影響”自己組織文字描述實驗結(jié)果，制作圖表。組別肌肉的收縮張力0.1ms0.5ms1ms10ms100ms1000ms12345678910x±s表3不同刺激波間隔的肌肉收縮張力（單位：克）實驗注意事項破壞腦脊髓不要擠壓蟾蜍頭部兩側(cè)大的耳后腺，避免蟾酥濺入眼內(nèi)。操作過程中避免過度牽拉神經(jīng)和肌肉，避免用手和鐵器觸碰神經(jīng)和肌肉，經(jīng)常給神經(jīng)和肌肉滴加任氏液，以免干燥。實驗過程中保持換能器與標本連線的張力不變。因為影響腓腸肌收縮力的主要因素有前負荷、后負荷、腓腸肌本身的收縮能力。分離坐骨神經(jīng)肌肉標本前洗手洗器械數(shù)據(jù)保存：按下“停止”按鈕，選中菜單欄“文件”主菜單欄下的“另存為”，將當前數(shù)據(jù)另外取文件名存至硬盤安全衛(wèi)生各小組衛(wèi)生剪刀、探針、玻璃皿用水沖洗所有器械擦拭干凈，無水跡實驗臺面整潔、干凈值日組衛(wèi)生:督查各組善后工作；掃地、拖地，凳子放整齊；清潔洗滌臺動物尸體討論：閾刺激與最大刺激1.腓腸肌大多數(shù)是快顫搐型肌纖維[1]

，支配腓腸肌收縮的神經(jīng)是A

纖維，A

纖維的直徑有很大差異，其閾值也有較大差異[1，2]。單干恒定時間的方波電壓刺激坐骨神經(jīng)干，電壓低于閾值的強度刺激，坐骨神經(jīng)干支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮，其所支配的肌細胞也不會發(fā)生興奮和收縮。刺激電壓達到閾強度時，坐骨神經(jīng)干中閾值最低的神經(jīng)開始興奮，其所支配的運動單位的肌纖維興奮并發(fā)生收縮，刺激強度逐漸增大，坐骨神經(jīng)干中興奮的神經(jīng)纖維增加，興奮和收縮的運動單位增加，其所募集的收縮張力也增加。刺激電壓達到使支配腓腸肌的A

纖維全部興奮，腓腸肌全部的運動單位增加都興奮并收縮，收縮張力達單收縮最大值。閾刺激

在單個刺激，刺激持續(xù)時間、強度-時間變