高效制備色譜

11.9高效制備色譜〔HighPerformancePreparativeChromatography〕任何一種別離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例外〔注意實(shí)際效果！〕。本章僅介紹常用的液相色譜方法。制備色譜是指采用色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即別離、收集一種或多種色譜純物質(zhì)。而利用高效液相色譜別離足夠量的混合物，并把別離所得的各組分逐個(gè)收集起來(lái)，得到高純度的樣品，稱(chēng)為高效液相制備色譜?？梢?jiàn)，制備色譜中的“制備”這一概念指獲得足夠量的單一化合物，以滿(mǎn)足研究和其它用途。制備色譜的出現(xiàn)，使色譜技術(shù)與經(jīng)濟(jì)利益建立了聯(lián)系。制備量大小和本錢(qián)上下是制備色譜的兩個(gè)重要指標(biāo)。氣相制備色譜主要用于石油化工產(chǎn)品和揮發(fā)性天然產(chǎn)物的色譜純樣品制備。表11.9.1儀器分析所需純樣品量

儀器樣品量（mg）NMR1-10FT-IR0.1-1IR1UV-Vis<1元素分析1-10MS0.01-1全面鑒定一樣品結(jié)構(gòu)10-50分離度分析速度分離樣品量思考：這三個(gè)指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同別離目的有不同要求。請(qǐng)具體分析：1〕別離分析2〕制備別離評(píng)價(jià)制備色譜效率的主要指標(biāo)是單位時(shí)間內(nèi)別離純物質(zhì)的量，以純組分量和該組分保存時(shí)間之比表示，定義為產(chǎn)率。另一指標(biāo)是最大允許別離樣品體積，它決定于固定相的負(fù)荷和色譜柱尺寸。塔板高度，mm容量因子1E-51E-41E-31E-2樣品量圖樣品量對(duì)塔板高度和容量因子的影響表11.9.2制備色譜和分析色譜的比較制備色譜分析色譜分離目的單位時(shí)間內(nèi)獲得符合純度的物質(zhì)量獲得混合物中各組分的信息（定性定量）色譜模型非線(xiàn)性色譜線(xiàn)性色譜儀器設(shè)備制備柱、高流量、大進(jìn)樣、低檢測(cè)（高通量）高壓穩(wěn)流、高精度進(jìn)樣、高靈敏檢測(cè)（高重現(xiàn)性）液相色譜制備純物質(zhì)的目的：結(jié)構(gòu)鑒定，生物和毒理試驗(yàn)，以及某些珍貴或難別離單組分物質(zhì)的生產(chǎn)。11.9.1制備色譜別離的一般考慮任何制備別離的色譜模型都和分析別離的模型相類(lèi)似。在制備色譜中，容量因子取決于樣品量。如果柱子在超載的狀態(tài)下工作，增加柱長(zhǎng)比降低壓力、增加柱效效果好。當(dāng)然，制備色譜中的別離度比分析別離度更為重要。當(dāng)柱子在超載時(shí)，大量樣品進(jìn)入柱子，使得別離度、塔板數(shù)和容量因子隨超載的狀況而變化。在制備色譜過(guò)程中單位時(shí)間產(chǎn)量的提高可通過(guò)增加流速和增加柱子的載量來(lái)實(shí)現(xiàn)。圖不同進(jìn)樣量時(shí)流速對(duì)別離度的影響流速，cm/secl

大顆?！瞺50μm〕大直徑柱，在超載狀態(tài)下完成相對(duì)大量的制備11.9.2制備色譜模型在制備色譜中，為提高別離量，制備色譜一般是在非線(xiàn)性范圍內(nèi)運(yùn)行。非線(xiàn)性色譜是制備色譜的理論根底，非線(xiàn)性色譜方程可以用一個(gè)濃度波的運(yùn)動(dòng)方程表示。制備色譜的溶質(zhì)的保存時(shí)間：可見(jiàn)，許多流行于分析型液相色譜的概念或參數(shù)在制備色譜中不太適用。使用這些結(jié)論容易被引入歧途。如：別離度、柱效柱和峰型的對(duì)稱(chēng)性在討論制備色譜最正確化時(shí)往往很少考慮。制備色譜的三種運(yùn)行模式主成分多組分微量組分超載有溶質(zhì)超載和體積超載兩種。溶質(zhì)超載是指柱體積小，但樣品濃度超過(guò)吸附等溫線(xiàn)的線(xiàn)性范圍，出現(xiàn)的峰型不對(duì)稱(chēng)，峰前沿陡峭而后部拖尾；體積超載是指進(jìn)樣體積比較大，樣品濃度恒定，應(yīng)限制在吸附等溫線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內(nèi)，洗脫的峰型高、對(duì)稱(chēng)或是個(gè)大平頂。制備條件的選擇，包括上柱量、容量因子、選擇性以及柱效。Knox和Pyper研究指出，別離純化的根本參數(shù)是得到最大的選擇性和高濃度的制備物質(zhì)。在高濃度下，無(wú)論是溶質(zhì)超載還是體積超載都保證了制備產(chǎn)量的提高。但體積超載要比溶質(zhì)超載得到的產(chǎn)量低。高濃度的質(zhì)量超載，在別離過(guò)程中防止了大體積引起的峰的擴(kuò)張，在制備色譜中具有更大的優(yōu)點(diǎn)。

制備色譜的進(jìn)樣體積：

對(duì)于k’=4，流出液組分濃度可達(dá)0.03%--0.3%，大小與α有關(guān)。

最大純化產(chǎn)量與容量因子的關(guān)系分析別離增加別離度增大進(jìn)樣量超載條件11.9.3實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1〕柱體積與填料液-固色譜是制備色譜中常用的一種模式，而液-固色譜中流動(dòng)相選擇很重要。流動(dòng)相首先應(yīng)使制備組分有較大的溶解度，且容易從純化后的組分中除去。一般小顆?！?-10μm〕用于高別離度的制備，粗顆?！?0-60μm〕用于超載的高容量制備。樣品容量的大小與填料的用量有關(guān)，而與顆粒度的關(guān)系不大。均勻的粗顆粒填料，多用于高樣品量的制備。內(nèi)徑，填有10μm顆粒度的填料的半制備柱，多用于重復(fù)別離和提純產(chǎn)品的制備。另一種類(lèi)型的制備柱是徑向壓縮柱：內(nèi)管采樣塑料管，可自己裝填規(guī)膠等填料。使用時(shí)，在管壁四周加壓，大大減少了填料顆粒之間，以及填充床管與管壁之間空體積，從而提高了柱效。1〕流動(dòng)相對(duì)于非極性或中極性的有機(jī)合成產(chǎn)物，常用硅膠柱別離。流動(dòng)相應(yīng)首先用己烷和特丁基甲醚，后者作為極性改性劑調(diào)節(jié)溶劑極性，且不會(huì)生成過(guò)氧化物。如果要提高選擇性和改變極性，用二氯甲烷比較適宜。加壓

1〕樣品前處理粗制品預(yù)先用抽提、蒸餾或重結(jié)晶等方法凈化。合成產(chǎn)物一般用快速柱色譜粗別離。必要時(shí)，在制備色譜前加一保護(hù)柱，防止雜質(zhì)損壞制備柱。2〕純組分的回收收集后的樣品組分的有機(jī)溶劑一般用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式除去；水分那么采用冷凍枯燥除去；流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑常用閃蒸方式回收。采用制備色譜得到的純物質(zhì)的主要雜質(zhì)可能是流動(dòng)相中的不溶物，如填料離解物。11.9.4制備色譜儀l

輸液能力達(dá)100mL/min，壓力在200kg/cm2左右l

進(jìn)樣器0.5~5mLl

檢測(cè)器：“縮小光程和采用分流”，如0.2~0.5cm的UV池或RI測(cè)定l

餾分收集器：定時(shí)收集或定體積收集l

再循環(huán)閥和溶劑再生裝置一般的分析型高效液相色譜儀可以換上內(nèi)經(jīng)在10mm的半制備柱完成一定的制備任務(wù)。11.9.5徑向流動(dòng)色譜色譜柱裝填成一定厚度的圓筒形狀，內(nèi)外圓柱用兩多孔濾膜固定。流動(dòng)相及樣品液從軸向進(jìn)樣口引入，徑向通過(guò)進(jìn)樣管流向柱子外周，樣品流過(guò)多孔濾膜后進(jìn)入色譜床開(kāi)始選擇性別離，最后由內(nèi)芯通道流出。與軸向流動(dòng)相比，徑向流動(dòng)的進(jìn)樣面積很大；柱壓降低；流量增大，有利于規(guī)模制備，特別是具有生理活性的大分子物質(zhì)的別離提純。但軸向流動(dòng)柱的設(shè)備較復(fù)雜，價(jià)格更貴。樣品液/溶劑流出液11.9.6應(yīng)用舉例合成中的制備色譜條件選擇一般應(yīng)參考薄層色譜條件、快速柱色譜初分條件、分析柱色譜或小規(guī)模柱別離探索別離條件，再擴(kuò)大到同類(lèi)型的制備柱別離。如對(duì)復(fù)雜樣品或未知樣品的提取和純化，通常采用分析柱探索別離條件，然后按規(guī)模放大別離。在一般情況下，制備色譜的別離度()應(yīng)大于1.25，根據(jù)制備規(guī)模選擇色譜柱，然后分析色譜的優(yōu)化條件放大進(jìn)樣量、流速以及梯度條件等，最后在制備色譜中進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在合成反響中，常采用點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定。一般的說(shuō)，比移值在0.2~0.8的化合物較適合于制備色譜。根據(jù)關(guān)系式可以估計(jì)制備色譜的流動(dòng)相組成。考慮到薄層板可能含有粘合劑、熒光劑等，流動(dòng)相的組成要進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。1〕制備手性色譜拆分氧氟沙星光學(xué)異構(gòu)體2〕合成羥基吡咯烷類(lèi)化合物的制備純化3〕高效液相制備別離抗氧劑1010加成反響副產(chǎn)物HPLC拆分氧氟沙星〔氟哌酸〕國(guó)內(nèi)使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已開(kāi)發(fā)左旋氧氟沙星〔LEVOFLOXCIN〕,商品名Cravit。用6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)OFLS-(-)-OFLR-(+)-OFL色譜新技術(shù)〔結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研自學(xué)〕高速逆流色譜(High-speedCountercurrentChromatography,HSCCC)連續(xù)逆流液液萃取:不用固態(tài)載體的液相分配色譜技術(shù)工作原理：一種獨(dú)特的流體動(dòng)力學(xué)現(xiàn)象一種連續(xù)的實(shí)用別離制備技術(shù)HSCCC是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院Ito博士研制開(kāi)發(fā)的一種獨(dú)特的不用固態(tài)載體的液相分配色譜技術(shù),是一種能實(shí)現(xiàn)連續(xù)有效別離的實(shí)用別離制備技術(shù)。逆流色譜是一種基于連續(xù)逆流液液萃取的色譜型別離裝置,它與不需要固相載體,只需要一個(gè)適宜的萃取別離體系。裝有不相混溶兩相液體的容器(轉(zhuǎn)鼓)在一個(gè)力場(chǎng)中轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)會(huì)造成一個(gè)多級(jí)的混合澄清體系,被別離的溶質(zhì)在流出液中通常會(huì)呈現(xiàn)各個(gè)別離的譜峰。HSCCC螺旋管內(nèi)區(qū)混合運(yùn)動(dòng)示意圖

兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的運(yùn)動(dòng)分布：兩相溶劑體系在螺旋管內(nèi)存在兩種狀態(tài)〔左圖〕,一種是在背離中心軸的螺旋管內(nèi),互不相溶的兩相處于別離的位置,較重相(下相)處于螺旋管外側(cè),輕相(上相)處于螺旋管內(nèi)側(cè)。在朝向公轉(zhuǎn)軸線(xiàn)的方向的區(qū)域兩相劇烈的接觸、混合、分配和傳遞。隨著流動(dòng)相不斷的注入流出,樣品中分配系數(shù)小的組分先被洗脫出來(lái),分配系數(shù)值較大的組分后被洗脫出來(lái),最終到達(dá)別離的目的。工作原理：利用的是螺旋管的方向性與高速行星式運(yùn)動(dòng)相結(jié)合產(chǎn)生的一種獨(dú)特的流體動(dòng)力