乳腺癌反義寡核苷酸治療的研究進(jìn)展(全文)

精品文檔-下載后可編輯乳腺癌反義寡核苷酸治療的研究進(jìn)展(全文)【關(guān)鍵詞】乳腺癌反義寡核苷酸基因綜述文獻(xiàn)

反義寡核苷酸技術(shù)(asodn)作為一種新的分子生物學(xué)工具及新型藥物受到醫(yī)療界越來越多的關(guān)注。許多反義藥物作為抗腫瘤藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，并取得了令人欣喜的效果。

1反義寡核苷酸的作用機(jī)理簡介

1.1反義寡核苷酸是在體外人工合成的能與體內(nèi)某rna或dna序列互補(bǔ)結(jié)合的短序列單鏈dna。它可以作為反義藥物與細(xì)胞內(nèi)特異的靶序列互補(bǔ),從而抑制基因表達(dá)。該技術(shù)的作用原理主要通過下列途徑發(fā)揮作用：（1）asodn與dna結(jié)合，抑制dna復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，它通過在dna結(jié)合蛋白的識別點(diǎn)處與dna雙螺旋結(jié)合形成三螺旋，阻止基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。(2)asodn可影響真核生物mrna核內(nèi)加工的步驟，如5’端加帽結(jié)構(gòu)、3’端加polya及剪接的過程，從而抑制了mrna的成熟過程。(3)asodn與目標(biāo)mrna特異性堿基互補(bǔ)結(jié)合，阻斷rna加工、成熟，阻止核糖體與起始因子的結(jié)合，影響核糖體沿mrna移動，從而阻止翻譯。

1.2天然的asodn能夠很快被在細(xì)胞內(nèi)存有的大量的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶降解。因此，asodn必須要經(jīng)過修飾才能在體內(nèi)發(fā)揮作用。研究表明，硫代修飾之后的asodn穩(wěn)定，具有良好的水溶性，并容易大批量人工合成來應(yīng)用于臨床的研究。所以，目前硫代磷酸型的asodn已應(yīng)用于各個水平的研究領(lǐng)域中。

1.3反義寡核苷酸在乳腺癌的治療研究中的應(yīng)用主要通過抑制乳腺癌細(xì)胞生長、增殖、分化誘導(dǎo)凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，降低乳腺癌的多藥耐藥性來實(shí)現(xiàn)。

1.4反義基因技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，由于dna序列在一般情況下是單拷貝，而mrna是多拷貝，因此asodn相比于反義rna只需少量的odn與dna靶序列結(jié)合，就可以具有很強(qiáng)的抑制效果。它治療乳腺癌特異性高，副作用少，與化療、放療和靶向藥物結(jié)合有協(xié)同作用，并已逐步從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。

2針對主要的進(jìn)入臨床前試驗(yàn)的致乳腺癌基因的反義寡核苷酸的研究

理論上認(rèn)為任何致乳腺癌基因都可以成為asodn的作用靶點(diǎn)，目前主要以細(xì)胞凋亡抑制基因、乳腺癌轉(zhuǎn)移和血管生成基因、生長因子及受體、信號傳導(dǎo)通路等作為常用的分子靶點(diǎn)。目前已有蛋白激酶c，bcl-2，ras/raf激酶，pka，p53/mdm2,聚集素(clusterin),dna甲基轉(zhuǎn)移酶，核苷酸還原酶進(jìn)入臨床試驗(yàn)?，F(xiàn)針對進(jìn)入臨床前試驗(yàn)的反義寡核苷酸治療乳腺癌所選擇的靶點(diǎn)作一綜述。

2.1survivin

survivin是一種凋亡抑制基因，定位于17q25上，在正常分化成熟組織（胸腺、胎盤、子宮內(nèi)膜除外）中未見表達(dá)。在人類癌癥中survivin過度表達(dá)，并且與化療放療耐受及較差的預(yù)后有關(guān)。另外，在erbb2過度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株中往往有高表達(dá)的survivin。

luj等用反義寡核苷酸抑制survivin表達(dá)可以減慢erbb-2過度表達(dá)細(xì)胞的有絲分裂速度，并且能夠使其對促腫瘤細(xì)胞凋亡藥物增加。yaoh等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用adkdr-cdglytk及survivin反義寡核苷酸對乳腺癌腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞有顯著殺傷效果。張靜[1]等利用asodn封閉survivin基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)asodn可明顯抑制survivin基因在乳腺癌細(xì)胞株mcf-7和mda-mb-231中的轉(zhuǎn)錄及翻譯，明顯提高乳腺癌對多西他賽的敏感性。扈煜[2]等采用脂質(zhì)體介導(dǎo)survivinasodn轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系mcf-7發(fā)現(xiàn)survivinasodn可有效下調(diào)mcf-7的survivinmrna及蛋白表達(dá)水平，并增強(qiáng)其對長春瑞濱的敏感性。韓芳等發(fā)現(xiàn)survivinasodn還可增強(qiáng)mcf-7對紫杉醇藥物的敏感性。

2.2vegf-a/vegf-c

血管內(nèi)皮生長因子（vegf）是一種促血管形成因子，在體外能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，在體內(nèi)能夠促進(jìn)血管新生。vegf-a可能是最強(qiáng)的促血管生成因子，同時vegf-c是vegf家族中最強(qiáng)的促淋巴管生成因子。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與腫瘤脈管生成密切相關(guān)。因此vegf-a/vegf-c可以成為治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。

chenjs等人進(jìn)行針對vegf-c反義寡核苷酸的動物體內(nèi)試驗(yàn)。先將vegf-casodn注入乳腺癌裸鼠原位移植瘤的模型中，檢測腫瘤組織vegf-a/vegf-cmrna表達(dá)和蛋白表達(dá)，并計算腫瘤微血管密度（mvd）和微淋巴管密度（lmvd）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義組較對照組成瘤時間長，移植瘤生長速度慢，腫瘤重量小，vegf-a和vegf-cmrna及蛋白表達(dá)弱，且mvd及l(fā)mvd低。

曲明陽等將vegf-casodn以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，檢測vegf-cmrna表達(dá)水平，乳腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附及侵襲人工基底膜能力和乳腺癌細(xì)胞中mmp-2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，vegf-casodn可能通過下調(diào)mmp-2表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞體外試驗(yàn)中的黏附和侵襲能力。zhaoxh等探究了g4pamam/vegfasodn復(fù)合物對mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞中的vegf和vegfmrna表達(dá)的影響和對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果顯示，g4pamam/vegfasodn在ph5-10的環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，且與對照組相比，在g4pamam/vegfasodn轉(zhuǎn)染后的mda-mb-231細(xì)胞中vegf蛋白表達(dá)減少。

2.3乙酰肝素酶（hpse）

乳腺癌的預(yù)后與侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）和基底膜（bm）在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程中起屏障作用。hpse是唯一的哺乳動物的糖苷內(nèi)切酶，可降解ecm和bm中的hs，它的活動與腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成，及癌癥病人術(shù)后的存活率密切相關(guān)。zhangl等證實(shí)人上皮生長因子受體2(her2)/上皮生長因子受體（efgr）表達(dá)的乳腺癌腦轉(zhuǎn)移病人中，hpse存在并表現(xiàn)出功能活性，與her2狀態(tài)相關(guān)聯(lián),并有潛力成為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移治療干預(yù)的靶點(diǎn)。

張友磊等設(shè)計合成hpseasodn，并用陽離子脂質(zhì)體lipofectin包埋后轉(zhuǎn)染人乳腺癌mda435細(xì)胞，并建立人乳腺癌裸小鼠皮下侵襲模型和急性血路轉(zhuǎn)移模型檢測hpsemrna表達(dá)和hpse蛋白表達(dá)的變化，計數(shù)裸小鼠肺表面腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目。結(jié)果顯示，hpseasodn通過下調(diào)hpsemrna和蛋白表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。

2.4端粒酶（telomerase）

muller和mcclintock發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞線性染色體末端有一特殊結(jié)構(gòu)，稱為端粒，它是由簡單重復(fù)富含g的dna序列和端粒結(jié)合蛋白的組成的一種白復(fù)合物。端粒酶則是由rna和蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種核糖蛋白體，它是一種能以自身rna為模板，反轉(zhuǎn)錄合成端粒dna重復(fù)序列從而延長端粒末端的特異性逆轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶復(fù)合體包括人端粒酶rna(htr)，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（htert）等。它在超過90%的乳腺癌中表達(dá)，但在鄰近的正常組織中不表達(dá)，這使得端粒酶成為治療乳腺癌的新靶點(diǎn)。

許多學(xué)者提出了以反義核苷酸封閉htr,從而抑制端粒酶活性，達(dá)到抑制腫瘤的效果。如natarajans等發(fā)現(xiàn)在抑制端粒酶表達(dá)中，用htr反義寡核苷酸要比針對htertmrna更為有效。lizg等設(shè)計試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用2.0umol/l的asodn轉(zhuǎn)染mcf-7細(xì)胞中端粒酶的活性以時間依賴方式顯著減少，以致細(xì)胞凋亡。

2.5ki-67

ki-67是一種核增殖標(biāo)志基因，在核增殖細(xì)胞中表達(dá)，而不在休眠細(xì)胞中表達(dá)。因此它與腫瘤的發(fā)生于發(fā)展密切相關(guān)，具有抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。蔡會龍等檢測了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中ki-67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ki-67蛋白與浸潤性導(dǎo)管癌tnm分期密切相關(guān)。

kauschi等利用ki-67mrna合成的反義寡核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)對ki-67蛋白表達(dá)的反義抑制可能是一個抗腫瘤治療合理途徑。汪蕊等構(gòu)建ki-67反義核酸載體，并研究阻斷ki-67基因的表達(dá)對mda-mb-435s細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ki-67反義核酸載體組的mda-mb-435s細(xì)胞ki-67mrna和蛋白表達(dá)明顯低于對照組，且細(xì)胞增殖首抑制，體外侵襲能力也明顯降低。

2.6her-2

her-2是egf受體家族的成員，定位于染色體17q12-21.32上，編碼相對分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白。her-2參與細(xì)胞生長增殖。在≥50歲的早期乳腺癌患者中，腫瘤分級和種類與her-2表達(dá)密切相關(guān)。并且在15%—30%的乳腺癌病例中，her-2過度表達(dá)，并與較差的預(yù)后和短存活時間相關(guān)。

sunjz等針對her-2mrna探究反義寡核苷酸對乳腺癌腫瘤生長的抑制作用。方法是將過度表達(dá)her-2的乳腺癌細(xì)胞株sk-br-3皮下注入balb/c裸鼠中。使用ha6722反義寡核苷酸，時間和劑量為變化量，觀察腫瘤抑制率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對her-2mrna的反義寡核苷酸以特異性序列和劑量依賴的方式對乳腺癌的生長進(jìn)行抑制。

asodn作為一種新的分子生物學(xué)工具及基因治療手段，在治療乳腺癌的應(yīng)用中受到越來越多的重視，但仍有許多問題需要解決，比如如何提高轉(zhuǎn)染率，如何選擇特異性靶點(diǎn)，如何提高asodn與靶點(diǎn)的親和力，如何防止細(xì)胞內(nèi)酶對asodn的降解等。但我們相信隨著asodn技術(shù)的發(fā)展，asodn的應(yīng)用必將成為臨床