生物人教版選修3學(xué)案1-1DNA重組技術(shù)的基本工具

專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具知識點(diǎn)一基因工程的概念與原理1．基因工程的概念(1)基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。(2)對基因工程概念的深度理解別名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)目的定向改造生物的遺傳性狀注意：加熱殺死的S型細(xì)菌和活的R型細(xì)菌一起培養(yǎng)能得到活的S型細(xì)菌，此實驗的原理是基因重組，是外源基因在自然狀態(tài)下導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，因此不屬于基因工程的范疇。2．基因工程的原理基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因(目的基因)在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效地表達(dá)。具體地說，基因工程就是在DNA分子水平上對基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。說明：對于基因突變而言，變異是不定向的，但基因工程使生物產(chǎn)生新的性狀變異，卻是定向的，是按照人們的實際需要進(jìn)行的有目的的改造?；蛑亟M的三種主要類型1．基因的交叉互換：減數(shù)第一次分裂四分體時期，同源染色體上的非姐妹染色單體間的交叉互換。2．基因的自由組合：減數(shù)第一次分裂后期，非同源染色體上的非等位基因隨著非同源染色體的自由組合而組合。3．基因工程：轉(zhuǎn)基因生物因外源基因?qū)攵@得的新性狀是可以遺傳的?！镜漕}精練1】20世紀(jì)70年代，科學(xué)家創(chuàng)立了一種新的生物技術(shù)——基因工程，實施該工程的最終目的是()A．定向提取生物體的DNA分子B．定向地對DNA分子進(jìn)行人工剪切C．在生物體外對DNA分子進(jìn)行改造D．定向地改造生物的遺傳性狀【解析】基因工程是在生物體外通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”等過程，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性生殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，創(chuàng)造出人類所需的基因產(chǎn)物，也就是定向地改造生物的遺傳性狀?！敬鸢浮緿解題歸納基因工程最突出的優(yōu)點(diǎn)是打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限，可以使原核生物之間、動植物之間、原核生物與真核生物之間，甚至人與其他生物之間的遺傳信息進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)移?；蚬こ趟罁?jù)的原理是異源DNA(基因)重組?！镜漕}精練2】下列敘述符合基因工程概念的是()A．在細(xì)胞內(nèi)直接將目的基因與宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行重組，賦予生物新的遺傳特性B．將人的干擾素基因重組到質(zhì)粒上后導(dǎo)入大腸桿菌，獲得能產(chǎn)生人干擾素的菌株C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發(fā)生改變，通過篩選獲得青霉素高產(chǎn)菌株D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細(xì)菌后其DNA整合到細(xì)菌DNA上【解析】基因工程是在生物體外將DNA進(jìn)行重組，賦予生物以新的遺傳特性，A錯誤；B項符合基因工程的概念；C項屬于誘變育種；D項外源基因?qū)爰?xì)菌不是人為操作的，不屬于基因工程的范疇?！敬鸢浮緽知識點(diǎn)二限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”1．限制性核酸內(nèi)切酶的概念、來源及作用概念限制性核酸內(nèi)切酶是能夠識別和切割DNA分子的酶，又稱為限制酶來源多數(shù)來自原核生物作用特點(diǎn)對雙鏈DNA分子上某種特定的核苷酸序列進(jìn)行識別與切割，具有專一性作用實質(zhì)使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開作用結(jié)果切斷DNA，形成的DNA片段末端有兩種形式——黏性末端和平末端1．限制酶是一類酶，而不是一種酶。2．限制酶的成分均為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。3．限制酶作為酶類，其催化作用具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點(diǎn)。其專一性表現(xiàn)為每種限制酶只能識別雙鏈DNA分子中特定的脫氧核苷酸序列，并從特定的位點(diǎn)切割雙鏈DNA分子。當(dāng)識別序列發(fā)生基因突變后，原限制酶將無法進(jìn)行切割。4．限制酶主要來源于原核生物，如細(xì)菌。在原核細(xì)胞內(nèi)，限制酶起切割外源DNA，防止寄生生物侵染的作用。含有某種限制酶的微生物的DNA分子中通常不具備該酶的識別序列，或通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到識別序列的堿基上，從而使自身的DNA相安無事。2．黏性末端和平末端(1)黏性末端：是限制酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開形成的，如下圖所示。(2)平末端：是限制酶在識別序列的中心軸線處將DNA的兩條鏈分別切開形成的，如下圖所示。說明：黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有相同堿基序列而且堿基互補(bǔ)配對的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對重新結(jié)合，而具有平末端的兩個DNA片段不容易結(jié)合。3．限制酶的識別序列的特點(diǎn)在限制酶所識別的序列上，都可以找到一條中心軸線，如圖所示，中心軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如：eq\b\lc\\rc\|(\a\vs4\al\co1(\o(\s\up17(GC),\s\do15(CG))))eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(\o(\s\up17(GC),\s\do15(CG))))以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱；eq\o(\s\up17(CCAGG),\s\do15(GGTCC))為eq\o(\s\up17(A),\s\do15(T))為軸，兩側(cè)堿基互補(bǔ)對稱。對限制酶切割DNA分子后的情況分析1．限制酶切割DNA分子后產(chǎn)生的具有平末端的兩個DNA片段不容易結(jié)合。2．若用限制酶切割后的DNA分子長度不變，則該DNA分子是環(huán)狀的。3．不同限制酶可以切出相同的黏性末端，切割后的DNA分子的堿基可以互補(bǔ)配對，只是這種情況較少。如限制酶1識別序列及切點(diǎn)：—↓GATC—，限制酶3識別序列及切點(diǎn)：—G↓GATCC—，它們切割后的黏性末端相同。4．限制酶切割后的DNA分子自行斷開，不需要解旋酶?！镜漕}精練3】下列關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的敘述中，錯誤的是()A．它能在特殊位點(diǎn)切割DNA分子B．同一種酶切割不同的DNA分子產(chǎn)生的黏性末端能夠很好地進(jìn)行堿基配對C．它能任意切割DNA，從而產(chǎn)生大量DNA片段D．每一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別特定的核苷酸序列【解析】限制性核酸內(nèi)切酶是基因工程中所需的重要工具之一。每種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)上切割DNA分子。同一種酶切割不同的DNA產(chǎn)生的黏性末端的堿基能夠互補(bǔ)配對。【答案】C解題歸納限制酶具有專一性，一種限制酶只能識別特定的核苷酸序列，并且在特定切點(diǎn)切割，切割后得到相同的黏性末端或平末端，而且兩個黏性末端的堿基能夠互補(bǔ)配對。【典題精練4】下圖表示兩種限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA分子的特定序列，并在特定位點(diǎn)對DNA進(jìn)行切割的示意圖，請回答以下問題：(1)圖中甲和乙代表____________________________________。(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表________________________________。(3)圖中甲和乙經(jīng)過相應(yīng)操作均形成兩個片段，切口的類型分別為________、________。甲中限制酶的切點(diǎn)是________之間，乙中限制酶的切點(diǎn)是________之間。(4)由圖解可以看出，限制酶的作用特點(diǎn)是____________________________________________________________________________。(5)如果甲中堿基G發(fā)生基因突變，可能發(fā)生的情況是____________________________________________________?！窘馕觥拷忸}關(guān)鍵是弄清楚限制酶作用的特點(diǎn)。若基因突變剛好發(fā)生在限制酶切點(diǎn)部位，則該酶就不能識別變異后的堿基序列。從圖解可以看出，甲和乙代表的是不同的DNA片段，在相應(yīng)的限制酶(EcoRⅠ、HpaⅠ)的作用下，在特定的位點(diǎn)被剪切成兩部分。前者是在識別序列的中心軸線兩側(cè)分別切開，形成的末端是黏性末端；后者是在識別序列的中心軸線處切開，形成的末端是平末端?！敬鸢浮?1)有特殊脫氧核苷酸序列的DNA片段(2)兩種不同的限制酶(3)黏性末端平末端G、AA、T(4)能識別雙鏈DNA分子上特定的脫氧核苷酸序列，并從特定的位點(diǎn)將雙鏈DNA分子切開(5)限制酶不能識別切割位點(diǎn)知識點(diǎn)三DNA連接酶——“分子縫合針”1．DNA連接酶的概念能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3′羥基末端和5′磷酸末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩條DNA鏈連接起來的酶。2．DNA連接酶的種類根據(jù)酶的來源不同可分為：種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只能連接黏性末端可以連接黏性末端或平末端，但連接平末端的效率較低幾種工具酶的作用比較1．限制性核酸內(nèi)切酶與DNA連接酶的比較：(1)區(qū)別：作用應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶使特定部位的磷酸二酯鍵斷開用于提取目的基因和切割載體DNA連接酶在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建(2)兩者的關(guān)系可表示為：2．限制性核酸內(nèi)切酶與解旋酶的比較：(1)相同點(diǎn)：都是作用于DNA分子中的化學(xué)鍵。(2)不同點(diǎn)：作用部位不同，前者作用于磷酸二酯鍵，后者作用于氫鍵。3．DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：4.四種酶的作用部位圖解：(1)作用于a(磷酸二酯鍵)的酶：限制酶、DNA連接酶和DNA聚合酶。(2)作用于b(氫鍵)的酶：解旋酶?！镜漕}精練5】現(xiàn)有一長度為1000個堿基對(bp)的DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，用KpnⅠ單獨(dú)酶切得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同時酶切后得到200bp和600bp兩種長度的DNA分子。該DNA分子的酶切圖譜正確的是()【解析】從題干中“用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1000bp”，再結(jié)合選項中DNA分子的可能酶切圖譜分析可知，此DNA分子是環(huán)狀，故A、B排除。同理，從“用KpnⅠ單獨(dú)酶切得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子”，又可推知圖譜中應(yīng)有兩個KpnⅠ酶切位點(diǎn)，故選D?！敬鸢浮緿【典題精練6】下面幾種是限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成的部分片段。請回答下列問題：①eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…CTGCA,…G))②eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTTAA))③eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…TG,…AC))④eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTGCA))⑤eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…GC,…CG))(1)以上DNA片段是由________種限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的。(2)若要把相應(yīng)片段連接起來，應(yīng)選用________(填“DNA聚合酶”或“DNA連接酶”)。(3)找出能連接的對應(yīng)片段并寫出連接后形成的DNA分子：_________________________________________________________?！窘馕觥恳环N限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割。題中①④的黏性末端相同，是由同一種限制酶切割形成的，其他三種片段的末端都不相同，所以這些片段是4種限制性核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的。DNA連接酶與DNA聚合酶作用不同，DNA連接酶是在兩個DNA片段間形成磷酸二酯鍵，將兩條鏈上的兩個缺口同時連接起來?！敬鸢浮?1)4(2)DNA連接酶(3)eq\o(\s\up17(…CTGCAG…),\s\do15(…GACGTC…))知識點(diǎn)四基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”1．載體的作用基因工程中載體又稱為運(yùn)載體，主要作用是與含有外源基因(即目的基因)的DNA片段結(jié)合，將外源基因送入受體細(xì)胞中?；蚬こ讨械妮d體與細(xì)胞膜上的載體蛋白的區(qū)別項目基因工程中的載體細(xì)胞膜上的載體蛋白化學(xué)本質(zhì)雙鏈DNA分子蛋白質(zhì)基本單位脫氧核苷酸氨基酸2.載體必須具備的條件(1)能自我復(fù)制：能夠在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。(2)有切割位點(diǎn)：有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，供外源基因插入。(3)具有標(biāo)記基因：具有特殊的標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。(4)無毒害作用：對受體細(xì)胞無毒害作用，否則受體細(xì)胞將受到損傷甚至死亡。3．載體的種類(1)質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒是目前最常用的載體。(2)其他載體：λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。注意：天然質(zhì)粒要經(jīng)過人工改造后才能用作載體。1．獲取目的基因和切割載體時使用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。2．獲取一個目的基因需用限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生4個黏性末端或平末端。3．選擇限制酶切割位點(diǎn)必須保證標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測。4．為了防止目的基因自身環(huán)化，使目的基因和質(zhì)粒定向連接，切割目的基因兩邊的酶可以是不一樣的。5．切點(diǎn)所處位置必須在載體本身需要的基因片段之外，以避免載體因目的基因的插入而失活?！镜漕}精練7】作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件之一及理由是()A．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便于提供大量的目的基因B．具有多個限制酶切割位點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以便于為目的基因的表達(dá)提供條件D．能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選【解析】作為載體要攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞并使之表達(dá)，必須能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地保存并大量復(fù)制，以便于通過復(fù)制提供大量的目的基因。同時要具有某些標(biāo)記基因，以通過標(biāo)記基因是否表達(dá)來判斷目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，從而篩選受體細(xì)胞。載體要具有多個限制酶切割位點(diǎn)，以便于與外源基因連接?！敬鸢浮緼解題歸納細(xì)胞膜上的載體與基因工程中的載體的區(qū)別(1)化學(xué)本質(zhì)不同：細(xì)胞膜上的載體化學(xué)成分是蛋白質(zhì)；基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)、λ噬菌體的衍生物，也可能是生物，如動植物病毒等。(2)功能不同：細(xì)胞膜上的載體功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞；基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！镜漕}精練8】將ada(腺苷酸脫氨酶基因)通過質(zhì)粒pET28b導(dǎo)入大腸桿菌并成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶。下列敘述錯誤的是()A．每個大腸桿菌細(xì)胞至少含一個重組質(zhì)粒B．每個重組質(zhì)粒至少含一個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)C．每個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)至少插入一個adaD．每個插入的ada至少表達(dá)一個腺苷酸脫氨酶分子【解析】本題考查基因工程的相關(guān)知識。大腸桿菌成功表達(dá)腺苷酸脫氨酶，說明每個大腸桿菌細(xì)胞至少含有一個重組質(zhì)粒，且每個ada至少指導(dǎo)合成一個腺苷酸脫氨酶分子。重組質(zhì)粒的形成需先用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和質(zhì)粒形成相同的黏性末端，再在DNA連接酶的作用下將二者連接起來，形成重組質(zhì)粒，其中含有限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。不同的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)不同，不是每個限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)都需要插入ada，C錯誤。故選C?！敬鸢浮緾一、選擇題1．質(zhì)粒常用作基因工程中的載體，下列關(guān)于質(zhì)粒的描述不正確的是(A)A．質(zhì)粒只存在于細(xì)菌等原核生物中B．質(zhì)粒是很小的環(huán)狀DNA分子C．質(zhì)粒能夠自我復(fù)制D．質(zhì)粒上有一個或多個限制酶切割位點(diǎn)解析：質(zhì)粒存在于細(xì)菌和酵母菌等生物中。2．下列關(guān)于載體的敘述，錯誤的是(D)A．載體與目的基因結(jié)合后，實質(zhì)上就是一個重組DNA分子B．對某種限制酶而言，載體上最好只有一個切點(diǎn)，但還要有其他多種限制酶的切點(diǎn)C．目前常用的載體有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒D．載體要具有某些標(biāo)記基因，便于對其進(jìn)行切割解析：載體上的標(biāo)記基因是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。3．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識別序列及切割位點(diǎn)分別是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。下列選項分別表示四種質(zhì)粒，其中，箭頭所指部位為限制酶的識別位點(diǎn)，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為下圖所示目的基因載體的質(zhì)粒是(A)解析：由題圖可知，質(zhì)粒B上無標(biāo)記基因，不適合作為載體；質(zhì)粒C和質(zhì)粒D的標(biāo)記基因上都有限制酶的識別位點(diǎn)；只有質(zhì)粒A上既有標(biāo)記基因，且限制酶MunⅠ的切割位點(diǎn)不在標(biāo)記基因上。4．下列有關(guān)基因工程中限制性核酸內(nèi)切酶的說法，錯誤的是(C)A．一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B．限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度影響C．限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNAD．限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取解析：限制性核酸內(nèi)切酶的化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，它的活性受到溫度和pH的影響；限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)是能識別雙鏈DNA中特定的核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割，但不能識別和切割RNA；限制性核酸內(nèi)切酶主要是從原核生物體內(nèi)分離出來的。5．下列有關(guān)基因工程的工具的敘述，正確的是(B)A．基因工程的載體只有質(zhì)粒B．限制酶和其他酶一樣具有專一性，只能識別特定的核苷酸序列C．λ噬菌體的衍生物可以作為動物基因工程的載體D．天然質(zhì)粒均可以直接用作載體將目的基因送入受體細(xì)胞解析：基因工程中最常用的載體是質(zhì)粒，此外還有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等；λ噬菌體的衍生物不可作為動物基因工程的載體；天然質(zhì)粒往往不能直接作為載體，要根據(jù)不同的目的和需求進(jìn)行人工改造。6．用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分別作用于一個1000bp(1bp即1個堿基對)的DNA分子，同時對酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行凝膠電泳，在電場的作用下，酶切產(chǎn)物分開，凝膠電泳結(jié)果如圖所示。該DNA分子的酶切圖譜(單位：bp)正確的是(C)解析：A選項中的DNA用KpnⅠ單獨(dú)酶切后會得到600bp和200bp兩種長度的DNA分子，與題意不符，A錯誤；B選項中的DNA用KpnⅠ單獨(dú)酶切后會得到600bp和400bp兩種長度的DNA分子，與題意不符，B錯誤；C選項中的DNA用KpnⅠ單獨(dú)酶切后得到的DNA分子長度是1000bp，用EcoRⅠ單獨(dú)酶切后會得到200bp和800bp兩種長度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同時酶切后會得到200bp和400bp兩種長度的DNA分子，與題意相符，C正確；D選項中的DNA用KpnⅠ單獨(dú)酶切后會得到400bp和600bp兩種長度的DNA分子，與題意不符，D錯誤。7．利用某目的基因(圖甲)和P1噬菌體載體(圖乙)構(gòu)建重組DNA。限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)分別如圖所示(已知這三種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同)。下列分析錯誤的是(D)A．構(gòu)建重組DNA時，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體B．構(gòu)建重組DNA時，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體C．圖乙中的P1噬菌體載體只用EcoRⅠ切割后，含有兩個游離的磷酸基團(tuán)D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，再用DNA連接酶連接，只能產(chǎn)生一種重組DNA解析：構(gòu)建重組DNA時，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌體載體，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，A正確；分析甲圖，HindⅢ的酶切位點(diǎn)在第二個EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)的左側(cè)，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因兩端將形成不同的黏性末端，同樣用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌體載體也形成這兩種黏性末端，因此它們可構(gòu)成重組DNA，B正確；P1噬菌體載體為環(huán)狀DNA，其上只含有一個EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，因此用EcoRⅠ切割后，該環(huán)狀DNA分子變?yōu)殒湢頓NA分子，因每條鏈各含有一個游離的磷酸基團(tuán)，故切割后含有兩個游離的磷酸基團(tuán)，C正確；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌體后形成的黏性末端相同，可任意連接，不止產(chǎn)生一種重組DNA，D錯誤。8．下列有關(guān)如圖所示的黏性末端的說法，錯誤的是(C)A．甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能C．DNA連接酶的作用位點(diǎn)是b處D．切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段解析：據(jù)圖可知，切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶識別序列與切割位點(diǎn)分別是—GAATTC—(在G與A之間切割)、—CAATTG—(在C與A之間切割)、—CTTAAG—(在C與T之間切割)，即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的，A正確。甲、乙的黏性末端互補(bǔ)，所以甲、乙可以形成重組DNA分子；甲、丙的黏性末端不互補(bǔ)，所以甲、丙無法形成重組DNA分子，B正確。DNA連接酶可以恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，而b處是氫鍵，C錯誤。甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段為eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(—CAATTC—,—GTTAAG—))，其中沒有切割產(chǎn)生甲的限制酶的識別序列及酶切位點(diǎn)，所以切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段，D正確。二、非選擇題9．下圖為體外對DNA分子進(jìn)行切割和拼接的示意圖，請據(jù)圖回答以下問題：(1)EcoRⅠ是一種限制性核酸內(nèi)切酶，其識別序列是GAATTC，切割位點(diǎn)是鳥嘌呤脫氧核苷酸(或G)與腺嘌呤脫氧核苷酸(或A)之間的磷酸二酯鍵，切割產(chǎn)生的DNA片段末端形式為黏性末端。(2)將不同來源的DNA片段“縫合”起來，需要E·coli_DNA連接酶或T4DNA連接酶，它們均屬于DNA連接酶，作用是催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，將兩個雙鏈DNA片段“縫合”起來，其中能“縫合”兩個雙鏈DNA片段的平末端的酶是T4DNA連接酶。解析：圖解表示EcoRⅠ將兩個DNA分子在特定序列的特定位點(diǎn)切開并通過DNA連接酶進(jìn)行拼接的過程。E·coliDNA連接酶只能“縫合”兩個互補(bǔ)的黏性末端，而T4DNA連接酶既可以“縫合”兩個互補(bǔ)的黏性末端，也可以“縫合”平末端。10．下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點(diǎn)，下圖(1)、圖(2)中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請回答下列問題：(1)一個圖(1)所示的質(zhì)粒分子經(jīng)SmaⅠ切割前后，分別含有0、2個游離的磷酸基團(tuán)。(2)若對圖中質(zhì)粒進(jìn)行改造，插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越高。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時，不能使用SmaⅠ切割，原因是Sma_Ⅰ會破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化。(5)為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。(6)重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞。解析：(1)質(zhì)粒為小型環(huán)狀的DNA分子，環(huán)狀DNA分子中沒有游離的磷酸基團(tuán)；經(jīng)SmaⅠ切割后在切口處每端各含1個游離的磷酸基團(tuán)。(2)因SmaⅠ的識別序列中全部是G—C堿基對，而G—C堿基對間氫鍵數(shù)目比A—T堿基對間多，故插入的SmaⅠ酶切位點(diǎn)越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。(3)若用SmaⅠ切割質(zhì)粒和外源DNA，則質(zhì)粒中作為標(biāo)記基因的抗性基因的結(jié)構(gòu)被破壞，外源DNA中目的基因的結(jié)構(gòu)也會被破壞。(4)若只使用EcoRⅠ切割目的基因和外源DNA，則除了含目的基因的片段和質(zhì)粒連接外，質(zhì)粒和含目的基因的片段可能會自身連接而環(huán)化。(5)含目的基因的片段與質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒，需DNA連接酶將兩個DNA片段的末端“縫合”起來。(6)重組質(zhì)粒中的抗性基因是作為標(biāo)記基因，以便于鑒別和篩選含有目的基因的細(xì)胞。[尋根問底]P4根據(jù)你所掌握的知識，你能推測這類酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？[提示]原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，限制酶會將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。[尋根問底]P6DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？[提示]不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coliDNA連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4DNA連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都能形成磷酸二酯鍵(在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成)，那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？(1)DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。(2)DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。[旁欄思考題]P6想一想，具備什么條件才能充當(dāng)“分子運(yùn)輸車”？[提示]能自我復(fù)制、有一個或多個切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因及對受體細(xì)胞無害等。[模擬制作]思考與討論P(yáng)71．你模擬插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？[提示]不能。因為一般基因有上千個堿基對。2．如果你操作失誤，堿基不能配對，可能是什么原因造成的？[提示]可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(也可能是其他原因)。[思考與探究]P71．限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…CTGCA,…G))(2)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…AC,…TG))(3)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(GC…,CG…))(4)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(…G,…CTTAA))(5)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1