國境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測方法

國境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了國境口岸流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒抗體(IgG/lgM)的檢測對象及方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于國境口岸入出境人員，可疑流感病毒或呼吸道合胞病毒感染者等人群的流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒抗體(IgG/lgM)檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，其他人群的抗體檢測也可參照。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單》適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語和定文下列術(shù)語和定義適用于本文件。甲型流感病毒是八節(jié)段RNA病毒，屬正粘病毒科，感染人可引起流感。乙型流感病毒是八節(jié)段RNA病毒，屬正粘病毒科，感染人可引起流感。副流感病毒屬副粘病毒科，基因組為單股負(fù)鏈RNA,感染人可引起善通感旨、氣管炎和肺炎。呼吸道合胞病毒respiratorysyncytialvirus.RSV呼吸道合胞病毒屬副粘病毒科，基因組為單股負(fù)鏈RNA.是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA本標(biāo)準(zhǔn)采用間接法，其原理是在固相包被板上包被抗原，用特異性抗人IgG/IgM的酶標(biāo)二抗檢測結(jié)合到包被板上的樣品中的特異性IgG/lgM抗體。底物反應(yīng)后，所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中1gG/lgM的含量成正比，IgG/lgM的含量可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。4(資料性附錄)ELISA檢測過程中技術(shù)要求A.1試劑的準(zhǔn)備A.1.1放冰箱內(nèi)保存的試劑，在使用前應(yīng)先恢復(fù)到室溫，一般在室濕平衡30min。A.1.2仔組檢查試劑各組分是否變質(zhì)。A.1.3濃縮的洗滌液需用新鮮的蒸餾水或去離子水按要求稀釋，使用不合格的蒸餾水可能使空白值增高。A.1.4保存試劑的冰箱應(yīng)定期檢查其儲存溫度(正常為2℃~8℃),并盡量避免冰箱頻繁開關(guān)。A.2標(biāo)本的采取與保存A.2.1盡量避免溶血。A.2.2血清標(biāo)本的制備：非抗凝自然凝固1h～2h,1500g～2000g離心5min,A.2.3標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。若5d內(nèi)檢測，可使用冰箱2℃~8℃保存，超過1周時(shí)間測定，應(yīng)于-20℃低溫凍存。A.3.1嚴(yán)格按照說明書要求，按規(guī)定的量和順序進(jìn)行。A.3.2使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。A.3.3加樣前應(yīng)使溶液充分混勻，并將液體加在孔底，避免加在反應(yīng)孔壁上部，注意不可出現(xiàn)氣泡。A.3.4加樣時(shí)避免樣本濺出，如有樣本濺出反應(yīng)孔外時(shí)，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干并消毒處理，同時(shí)做相應(yīng)記錄。A.3.5加樣后微孔板應(yīng)及時(shí)溫育，盡量縮短加樣后溫育前的等待時(shí)間。A.4.1嚴(yán)格按照說明書要求，按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行，并保證設(shè)定的溫度達(dá)到要求以及足夠的反應(yīng)時(shí)間。A.4.2保溫容器最好是恒溫培養(yǎng)箱，可使溫度很快達(dá)到平衡。A.4.3微孔板不可重疊放置，以免傳熱不均勻。A.4.4為道免孔內(nèi)液體蒸發(fā)，可用封板膠將ELISA板面密封后進(jìn)行溫育。A.4.5溫育時(shí)盡量少開啟箱門以保持箱內(nèi)溫度穩(wěn)定。A.5.1微孔板每遍洗板次數(shù)一般為3次，每次設(shè)計(jì)浸泡時(shí)間一般為30s~60s。A.5.2洗板時(shí)需保證微孔板平故，將洗滌液注滿各反應(yīng)孔，但盡量避免漏液溢液現(xiàn)象。(資料性附錄)ELISA檢測甲型流感病毒抗體(IgG/IgM)B.1在包被有甲型流感病毒抗原的反應(yīng)孔中加入100pl.標(biāo)準(zhǔn)品和已經(jīng)稀釋并處理的待檢血清樣品，同時(shí)加入陰性對照、陽性對照，封板后37℃孵育60min。B.2奔去反應(yīng)孔中的液體，用300pl.洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。B.3在反應(yīng)孔中加入100pl.酶標(biāo)抗人IgG/lgM抗體，封板后37℃解育30min。B.4奔去反應(yīng)孔中的液體，用300pl.洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。B.5向每孔中加入100pl.底物液，37℃下避光解育20min。B.6向每反應(yīng)孔中加入100pl.終止液，波體顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。B.7加終止液后60min內(nèi)在450nm處測定OD值。7C.1在包被有乙型流感病毒抗原的反應(yīng)孔中加入100μl.標(biāo)準(zhǔn)品和已經(jīng)稀釋并處理的待檢血清樣品，C.3在反應(yīng)孔中加入100pl.酶標(biāo)抗人IgG/lgM抗體，封板后37℃孵育30min。C.4棄去反應(yīng)孔中的減體，用300gl.C.5向每反應(yīng)孔中加入100pl.底物液.37℃下避光孵育20min。C.7加終止液后60min內(nèi)在450nm處測定OD值。D.1在包被有副流感病毒抗原的反應(yīng)孔中加入100pL標(biāo)準(zhǔn)品和已經(jīng)稀釋并處理的待檢血清樣品，同D.3在反應(yīng)孔中加入100yl.醇標(biāo)抗人1gG/lgM抗體，封板后37℃孵育30min。D.7加終止液后60min內(nèi)在450mm處測定OD值。(資料性附錄)ELISA檢測呼吸道合胞病毒抗體(IgG/lgM)E.1在包被有呼吸道合胞病毒抗原的反應(yīng)孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品和已經(jīng)稀釋并處理的待檢血清樣品，同時(shí)加入陰性對照、陽性對照，封板后37℃孵育60min。E.2奔去反應(yīng)孔中的液體，用300yl.洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。E.3在反應(yīng)孔中加入100pl.酶標(biāo)抗人IgG/lgM抗體，封板后37℃孵育30min。E.4棄去反應(yīng)孔中的減體，用300gl.洗滌液洗板