農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 品種質(zhì)量 品種真實(shí)性鑒定 征求意見稿

4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程品種質(zhì)量品種真實(shí)性鑒定本文件規(guī)定了農(nóng)作物種子品種真實(shí)性鑒定的適宜目標(biāo)、技術(shù)路徑、鑒定程序、結(jié)果表示等要求。本文件適用于農(nóng)作物種子。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文件中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/Txxxxx.x農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程品種質(zhì)量品種純度鑒定GB/Txxxxx.x農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程品種質(zhì)量轉(zhuǎn)基因種子鑒定GB/T6682分析檢驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語定義和縮略語下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1術(shù)語定義3.1.1品種鑒定內(nèi)容3.1.1.1品種身份驗(yàn)證varietyverification經(jīng)與其對應(yīng)品種名稱的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，鑒定供檢樣品標(biāo)注的品種名稱是否真實(shí)。3.1.1.2品種身份鑒定varietyidentification經(jīng)與其作物品種指紋數(shù)據(jù)比對平臺篩查比較，或通過田間小區(qū)比對種植，鑒定供檢樣品的品種真實(shí)名稱或與其他品種的同源性。3.1.1.3品種性狀特性鑒定varietytraitdetection經(jīng)檢測或篩查，鑒定供檢樣品具有轉(zhuǎn)基因或基因編輯等帶來的特定性狀。3.1.2DNA分子檢測法3.1.2.15DNA分子檢測DNAmoleculartests基于核酸分子水平的檢測，通過比較不同樣品或不同個(gè)體DNA序列表現(xiàn)結(jié)果，對品種質(zhì)量進(jìn)行鑒定的方式。品種真實(shí)性是通過比較不同樣品群體間的異同而獲得檢測結(jié)果的。3.1.2.2標(biāo)記marker通常用于與給定基因位座相匹配的DNA片段的一種遺傳標(biāo)記，以提供有關(guān)攜帶者基因型或鄰近基因座基因型的信息。常見標(biāo)記類型有簡單重復(fù)序列、單核苷酸多態(tài)性、插入缺失3.1.2.3簡單重復(fù)序列simplesequencerepeat（SSR）通常由1bp～6bp短序列（重復(fù)單元）組成的DNA區(qū)域，該序列連續(xù)重復(fù)通常為5～503.1.2.4單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphism（SNP）基因組中序列之間單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。3.1.2.5插入缺失insertion-deletion（InDel）在基因組序列上存在的插入或缺失序列。3.1.2.6引物primer與鑒定DNA序列片段互補(bǔ)的規(guī)定長度和序列的寡核苷酸，能提供3’-OH末端作為DNA合成的起始點(diǎn)，延伸合成模板DNA。3.1.2.7探針probe用于需要與鑒定目標(biāo)DNA雜交結(jié)合的具有特定序列的標(biāo)記核酸分子。3.1.2.8位點(diǎn)組合setoflocus形成每一品種具有獨(dú)特指紋能夠高效區(qū)分品種的優(yōu)先選用的一組位點(diǎn)。3.1.2.9聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction（PCR）允許體外擴(kuò)增DNA的酶促程序。3.1.2.10擴(kuò)增amplification通過DNA擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），產(chǎn)生的特定DNA片段。3.1.2.116電泳electrophoresisPCR產(chǎn)物通過電場下帶電粒子的差異遷移分離帶電粒子的程序。3.1.2.12雜交hybridization在適宜的反應(yīng)條件下互補(bǔ)核酸序列的特異性結(jié)合。3.1.2.13等位基因allele在一對同源染色體上同一基因座上的一對基因，有時(shí)也稱為等位變異。3.1.2.14空等位基因nullallele序列變異阻止特定靶點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致缺乏可鑒定的PCR產(chǎn)物。3.1.2.15等位基因頻率allelefrequency衡量等位基因在群體中的普遍程度,采用給定等位基因所占據(jù)的某一位點(diǎn)的所有出現(xiàn)的比例或百分比表示。3.1.3小區(qū)種植鑒定controlplottests選擇滿足鑒定作物正常生長周期所需基本條件的地塊，按照一定布局設(shè)置小區(qū)并種植種子樣品，在性狀典型時(shí)期通過觀察形態(tài)特征特性，對品種質(zhì)量進(jìn)行鑒定的方法。品種真實(shí)性是通過比較不同種子樣品間群體特征特性的異同而獲得鑒定結(jié)果的。3.1.4品種鑒定對照3.1.4.1參照樣品referencecontrolsample用于校準(zhǔn)檢測樣品等位基因等位變異且已定義基因型的樣品。3.1.4.2標(biāo)準(zhǔn)樣品standardsample國家指定機(jī)構(gòu)保存的經(jīng)認(rèn)定代表品種特征特性的實(shí)物種子樣品。3.1.4.3品種指紋數(shù)據(jù)比對平臺fingerprintblastplatform采用分子標(biāo)記的規(guī)定引物組合鑒定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品等位變異的信息，運(yùn)用數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)所構(gòu)建的品種分子數(shù)據(jù)信息的檢索比對載體。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：basepair，堿基對。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脫氧核苷三磷酸。KASP：競爭性等位基因特異性PCR（kompetitiveallelespecificPCR）。7PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶。4鑒定內(nèi)容4.1對于品種真實(shí)性鑒定，盡管其含義因不同場合所指的品種識別內(nèi)容不同而有所差異，但主要包括以下3項(xiàng)內(nèi)容：a.品種身份驗(yàn)證，主要用于核查樣品種子是否名副其實(shí)，如核查種子與其標(biāo)簽標(biāo)注的品種名稱是否一致；b.品種身份鑒定,主要用于確認(rèn)樣品種子所屬的品種名稱，如確認(rèn)某未知種子的品種名稱；c.品種性狀特性鑒定，主要用于鑒定樣品種子具有表達(dá)特定的性狀特性，如轉(zhuǎn)基因種子、基因編輯種子的品種識別。4.2除了4.1對送檢樣品的品種本身的身份識別外，品種真實(shí)性還包括該品種與另一品種或者與已知品種的關(guān)系程度的識別，主要包括以下3項(xiàng)內(nèi)容：a.品種間相似度識別，即該品種與另一品種的遺傳相似性程度比較，比如：是否屬于實(shí)質(zhì)性派生品種的認(rèn)定；b.品種同質(zhì)化識別，即該品種與已知品種的區(qū)別，比如：用于品種特異性的區(qū)分或創(chuàng)新性的評價(jià)；c.品種親緣關(guān)系識別，即該品種與親本種子品種的關(guān)系，比如：用于下一代與其親本的親緣關(guān)系認(rèn)定。4.3不同的鑒定內(nèi)容（4.1和4.2所列的），其鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度、精確度，既依賴于所需的引物組合、檢測平臺、樣品數(shù)量，也與對比的標(biāo)準(zhǔn)樣品或應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建的品種DNA指紋數(shù)據(jù)比對平臺有關(guān)。4.4對于品種真實(shí)性鑒定，應(yīng)依據(jù)“適于鑒定目的”的原則，統(tǒng)籌考慮檢測規(guī)模和檢測能力，擇定適宜的引物組合、檢測平臺、樣品數(shù)量，制定相應(yīng)的檢測方案，確保檢測結(jié)果穩(wěn)定一致。5通用要求5.1DNA分子檢測法5.1.1位點(diǎn)組合模式對于品種真實(shí)性鑒定，需要建立一套分子標(biāo)記引物組合、檢測方法以及參照樣品。檢測方法相同，但引物組合不同，同一品種可能會產(chǎn)生兩種不同的指紋數(shù)據(jù)；反之，引物組合相同，但方法不同，同一品種預(yù)期產(chǎn)生相同的指紋數(shù)據(jù)。因此，品種真實(shí)性鑒定采用固定引物（位點(diǎn)）而不固定檢測方法的模式。5.1.2分子標(biāo)記篩選5.1.2.1引物位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)對于品種DNA指紋圖譜和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，應(yīng)依據(jù)鑒定目標(biāo)選擇分子標(biāo)記。開始選擇分子標(biāo)記時(shí)，需要大量品種（包括研發(fā)的組合）進(jìn)行試驗(yàn)，以最大程度反映區(qū)分作物、種類、類型內(nèi)觀察到的分子標(biāo)記多樣性。采用適宜的品種組合的指紋圖譜來驗(yàn)證位點(diǎn)（引物）的表現(xiàn)。用于驗(yàn)證的品種組合可以8a.遺傳非常相似的品種或品系、近等基因系、重組自交系；b.親本和后代；c.遺傳相近但形態(tài)明顯不同的品種（例如突變品種）；d.不同譜系的一些形態(tài)相近的品種；e.不同批次的同一品種；f.不同來源的同一品種。5.1.2.2位點(diǎn)質(zhì)量選擇分子標(biāo)記應(yīng)具備以下條件：——不同的檢驗(yàn)室和不同的檢測平臺間的數(shù)據(jù)具有較高的重復(fù)性；——具有一定的品種區(qū)分能力；——能構(gòu)建數(shù)據(jù)庫；——操作流程簡便易操作。主要推薦SSR、SNP標(biāo)記作為當(dāng)前各作物種子真實(shí)性鑒定的主要標(biāo)記方法。根據(jù)不同物種的技術(shù)發(fā)展情況，其它標(biāo)記方法如InDel等經(jīng)過方法比較確認(rèn)后也可以選擇使用。不管分子標(biāo)記如何使用，選擇特定標(biāo)記或一組標(biāo)記的一般標(biāo)準(zhǔn)如下：a.圖譜數(shù)據(jù)評價(jià)應(yīng)符合檢驗(yàn)室內(nèi)和檢驗(yàn)室間的重演性、復(fù)現(xiàn)性和穩(wěn)健性的要求；b.分子標(biāo)記可從公共資源、來自商業(yè)化特定作物特異性的可獲得的芯片、新生成的序列數(shù)據(jù)選擇中獲??；c.獲得的圖譜數(shù)據(jù)易于客觀評價(jià)；d.盡可能避免選擇已確認(rèn)屬于“空”等位基因（沒有產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的等位基因）變異；e.相對于具有較高辨別力的顯性標(biāo)記，優(yōu)先選擇共顯性標(biāo)記；f.基于檢測目的，優(yōu)先選擇有明確定位信息的位點(diǎn)；g.在位點(diǎn)選擇時(shí)，宜考慮其作物自身特性。5.1.2.3位點(diǎn)數(shù)量達(dá)到必要分辨率或鑒別能力的標(biāo)記數(shù)量，宜與“檢測目的”所需基因型的準(zhǔn)確性相匹配。應(yīng)依據(jù)下列主要因素，確定具體作物的合適位點(diǎn)數(shù)量：a.檢測目的需求；b.標(biāo)記類型（顯性/共顯性；雙等位/多等位基因）；c.作物種類（作物染色體數(shù)目多少、基因組大小、品種數(shù)量及品種間差異情況等d.標(biāo)記性能（位點(diǎn)多態(tài)性水平）。位點(diǎn)數(shù)量需要根據(jù)不同作物的基因組大小及多態(tài)性水平來確定適宜的數(shù)量，一般SNP標(biāo)記多于SSR標(biāo)記數(shù)量。入選位點(diǎn)在染色體上盡量均勻分布，以減少位點(diǎn)間的遺傳連鎖。對于通用型的位點(diǎn)組合，應(yīng)能區(qū)分99%以上的已知品種。5.1.3分子標(biāo)記的確認(rèn)5.1.3.1分子標(biāo)記應(yīng)依據(jù)確認(rèn)程序，評估分子標(biāo)記的性能。經(jīng)確認(rèn)的標(biāo)記應(yīng)是穩(wěn)健的，能產(chǎn)生一致的DNA圖譜和統(tǒng)一的結(jié)果。所選的標(biāo)記組合應(yīng)適合目的，其精度是可測量的。確認(rèn)分子標(biāo)記組合的適用性，應(yīng)考慮以下要求：a.分辨能力（信息量）；b.重復(fù)性，即在同一檢驗(yàn)室，由相同操作者在短時(shí)間內(nèi)使用同一設(shè)備，以相同方法、相同鑒定項(xiàng)目重復(fù)檢測結(jié)果相同；c.復(fù)現(xiàn)性，即使用相同方法、相同試驗(yàn)項(xiàng)目、相同或不同檢驗(yàn)室、不同操作者、使用不9同設(shè)備的平行檢測結(jié)果相同；d.穩(wěn)健性，即測量參數(shù)在所述鑒定條件不受微小影響，并提供正常使用期間的偏差影響；e.錯(cuò)誤率。5.1.3.2為實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果一致，在共享數(shù)據(jù)庫的情況下，不同檢驗(yàn)室之間標(biāo)記物和方法的協(xié)調(diào)中應(yīng)考慮：a.使用代表廣泛等位基因的定義品種組合，作為所有檢驗(yàn)室的參考，以測試檢驗(yàn)室之間的一致性；b.選擇重復(fù)樣品、次級樣品或品種植株個(gè)體為檢測樣本，檢查DNA圖譜的一致性并估計(jì)檢驗(yàn)室之間的錯(cuò)誤率；c.根據(jù)所使用的標(biāo)記類型（如對SSR必需），可制定檢驗(yàn)室間等位基因/譜帶評價(jià)方案，用以對以下內(nèi)容作出評價(jià)：——稀有等位基因（即特定基因座上的基因在群體中出現(xiàn)頻率低于5～10%的一般商定）；——空等位基因（其效應(yīng)是在分子水平上PCR產(chǎn)物缺失的等位基因）；——“微弱”譜帶（即信號強(qiáng)度低于商定的檢測閾值，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或自動設(shè)置，其評價(jià)可能存在疑問）；——缺失數(shù)據(jù)（即一個(gè)或多個(gè)品種中沒有記錄數(shù)據(jù)的任何基因座）。5.1.4分子標(biāo)記檢測法選擇要求選擇產(chǎn)生高質(zhì)量分子數(shù)據(jù)的分子標(biāo)記檢測法，需要考慮以下重要因素：a.檢驗(yàn)室內(nèi)部和之間、檢測平臺（不同類型的設(shè)備）數(shù)據(jù)生成的復(fù)現(xiàn)性；b.長時(shí)間的重復(fù)性；c.分辨率；d.時(shí)間和勞動強(qiáng)度；e.在時(shí)間和條件（對方案或條件細(xì)微改變的敏感性）下表現(xiàn)的穩(wěn)健性；f.方法的靈活性、樣品數(shù)量和/或標(biāo)記數(shù)量變化的可能性；g.獨(dú)立于設(shè)備所產(chǎn)生數(shù)據(jù)解讀；h.數(shù)據(jù)庫的可持續(xù)性；i.方法可獲得性；j.特定機(jī)器、特定化學(xué)品、特定供應(yīng)商、特定合作伙伴或產(chǎn)品的獨(dú)立性；k.適合自動化；l.適合多重使用；m.成本效益（成本、樣品數(shù)量和標(biāo)記數(shù)量相匹配）。5.1.5方法可獲得性一些分子標(biāo)記和材料是公開的，然而，有些標(biāo)記物和其他方法和/或材料可能存在知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，在研發(fā)工作開始時(shí)宜處理好知識產(chǎn)權(quán)問題。5.2小區(qū)種植鑒定5.2.1品種特征特性的確定通過觀察小區(qū)植株群體，確定品種典型株及其特征特性。除非小區(qū)植株混雜嚴(yán)重，否則應(yīng)忽略小區(qū)內(nèi)雜株表現(xiàn)。5.2.2品種特征特性的比較比較不同小區(qū)植株群體典型株的特征特性，對于觀察到的差異，應(yīng)區(qū)分是遺傳變異還是環(huán)境條件引起的差異。經(jīng)確認(rèn)是環(huán)境引起的差異，應(yīng)忽略。6鑒定程序6.1DNA分子檢測法6.1.1總則不同的品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的DNA序列差異（簡單序列重復(fù)SSR，單核苷酸變異SNP這種差異或區(qū)別可通過從有代表性的混合試樣或個(gè)體試樣中提取DNA，采用SSR或SNP引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其擴(kuò)增產(chǎn)物加以區(qū)分，通過分析樣品間DNA位點(diǎn)差異鑒定品種真實(shí)性?？紤]到分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展以及不同作物基因組研究發(fā)展不平衡問題，本文件不規(guī)定每個(gè)作物的具體方法，有關(guān)具體鑒定方法建議可選擇已通過認(rèn)可的鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)，如國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（農(nóng)業(yè)部）公告（包括NY/T）等現(xiàn)行有效的鑒定方法標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)推薦了玉米、水稻和小麥的SSR檢測引物（附錄A）、SSR標(biāo)記鑒定程序（附錄B）和SNP標(biāo)記鑒定程序（附錄C）。6.1.2檢測平臺選擇6.1.2.1品種身份驗(yàn)證宜采用中、低通量檢測平臺。對于SSR標(biāo)記，可選擇采用變性PAGE電泳和毛細(xì)管電6.1.2.2品種身份鑒定和品種間相似比較宜采用中、高通量標(biāo)記檢測平臺。對于SSR標(biāo)記，宜采用毛細(xì)管電泳檢測平臺；對于SNP標(biāo)記，根據(jù)作物的技術(shù)研發(fā)現(xiàn)狀選擇使用單位點(diǎn)檢測平臺或SNP芯片檢測平臺。6.1.2.3品種性狀特性鑒定品種性狀特性鑒定法見GB/Txxxxx.3《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程品種質(zhì)量轉(zhuǎn)基因種子鑒定》中轉(zhuǎn)基因真實(shí)性檢測方法。6.1.3引物合成根據(jù)品種鑒定目的要求篩選鑒定引物，應(yīng)依據(jù)不同檢測平臺的PCR擴(kuò)增或雜交的質(zhì)量要求，合成相應(yīng)的引物或探針。6.1.4樣品DNA提取6.1.4.1樣品類型和數(shù)量供品種真實(shí)性鑒定的送檢樣品，包括種子、幼苗、葉片、根等材料。從送驗(yàn)樣品中分取有代表性的試驗(yàn)樣品，試驗(yàn)樣品數(shù)量應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?、試?yàn)方法、試驗(yàn)精度而確定。試驗(yàn)數(shù)量取決于種子繁殖方式及樣品一致性情況，可采用混合樣或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行檢測，一般需至少檢測30個(gè)個(gè)體的混合樣品（無性繁殖品種可適當(dāng)減少），必要時(shí)可對個(gè)體進(jìn)行分析。6.1.4.2DNA提取能達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法，均可適用。6.1.5PCR擴(kuò)增使用推薦的引物位點(diǎn)，選擇適合的檢測平臺，按照相應(yīng)檢測平臺的操作程序，對樣品進(jìn)行基因分型，獲得每個(gè)位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)。附錄B和C是推薦的SSR和SNP分子標(biāo)記檢測程序，也可采用其他能達(dá)到同樣效果的程序。在試驗(yàn)樣品PCR擴(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陽性對照（參照樣品）和空白對照作為質(zhì)控。不同的檢測平臺PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系不一樣，在確保對照樣品擴(kuò)增正常前提下，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積和組分的終濃度可以依據(jù)不同作物和不同試驗(yàn)條件作相應(yīng)調(diào)整。根據(jù)不同檢測平臺確定不同的反應(yīng)程序。6.1.6PCR產(chǎn)物檢測6.1.6.1數(shù)據(jù)采集6.1.6.1.1等位變異命名不同檢測平臺數(shù)據(jù)采集方式不一樣，為保證數(shù)據(jù)的兼容性，應(yīng)規(guī)定每個(gè)位點(diǎn)的所有等位變異的命名方式、參照樣品及其標(biāo)準(zhǔn)基因型數(shù)據(jù)。為了獲得一致的比對結(jié)果，基因分型結(jié)果需要通過規(guī)定程序進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。6.1.6.1.2位點(diǎn)異質(zhì)性采用混合樣檢測，無論是多等位還是二等位基因，結(jié)果表明在引物位點(diǎn)出現(xiàn)異質(zhì)性而無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)基因型的，宜采用單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測。若樣品呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性且無法形成確切鑒定結(jié)果時(shí),可終止品種真實(shí)性鑒定。6.1.6.2數(shù)據(jù)記錄6.1.6.2.1SSR位點(diǎn)對于片段大小的數(shù)據(jù)記錄，純合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中：X、Y分別代表該位點(diǎn)上兩個(gè)不同等位變異大小，X為小片段數(shù)據(jù)，Y為大片段數(shù)據(jù)，比如：292/292，252/273，缺失位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為“--”。6.1.6.2.2SNP位點(diǎn)以實(shí)際變異的A/T/C/G堿基字母直接編碼，兩位字母連續(xù)填寫，中間不加符號，如某個(gè)位點(diǎn)為A/G變異，則有AA、AG、GG三種基因型，缺失數(shù)據(jù)記錄為“--”。6.1.7數(shù)據(jù)比對與統(tǒng)計(jì)6.1.7.1與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較采用與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的，對甄別后的基因型，按照在同一批次試驗(yàn)的待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品逐個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較，確定其位點(diǎn)差異。6.1.7.2與DNA指紋數(shù)據(jù)比對平臺比較按照數(shù)據(jù)導(dǎo)入模板的要求，將數(shù)據(jù)（SSR標(biāo)記同時(shí)上傳指紋截圖）上傳到DNA指紋數(shù)據(jù)比對平臺，進(jìn)行逐個(gè)位點(diǎn)在線比對，核實(shí)確定其異同。6.1.7.13位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比對后，按照位點(diǎn)存在差異或相同、數(shù)據(jù)缺失、無法判定等情形，記錄每個(gè)引物的位點(diǎn)狀況。6.2小區(qū)種植鑒定6.2.1樣品準(zhǔn)備小區(qū)種植的株數(shù)，與作物種類有關(guān)。送驗(yàn)樣品的最小量應(yīng)符合GB/Txxxxx.3《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣》的規(guī)定。從送驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品中分取符合鑒定要求數(shù)量的種子樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品宜選擇育種家種子，或法定的種子標(biāo)準(zhǔn)樣品，特殊情況下可以使用標(biāo)準(zhǔn)樣品的等效樣品。6.2.2鑒定田準(zhǔn)備選擇適宜鑒定作物正常生長的區(qū)域，宜充分考慮該作物正常生長周期所需的光照、溫度等基本條件，使植株生長的特征特性得到充分的表現(xiàn)。若有符合植株光溫等條件的其他地方，可進(jìn)行反季節(jié)種植。鑒定田前茬一般要求無同類作物，可通過檢查該地塊的前作檔案確認(rèn)，確保清除了田塊的同類作物種子和影響鑒定的雜草種子。鑒定田宜地力均勻、田塊平整且無重大病蟲草害發(fā)6.2.3種植小區(qū)設(shè)計(jì)相同品種、相近品種的樣品以及與標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諛悠?，宜采取相鄰種植方式。同組比較品種應(yīng)同期播種。小株作物一般不少于60株，大株作物一般不少于30株。小區(qū)種植的布局設(shè)計(jì)應(yīng)以易于觀察為原則，宜采用品種間寬行種植，必要時(shí)加大株距，便于全生育期比較觀察小區(qū)植株。若條件允許，小區(qū)種植可增加平行小區(qū)或備份小區(qū)。6.2.4鑒定田管理鑒定田中等水肥條件管理，盡可能充分展現(xiàn)品種特征特性和品種差異。應(yīng)小謹(jǐn)慎使用除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等，避免影響植株的特征特性。小區(qū)種植的其他栽培管理，同大田糧食、豆類、飼料的生產(chǎn)栽培要求相類似。6.2.5小區(qū)鑒定可于全生育期內(nèi)選擇適宜時(shí)期開展鑒定，一般在成熟期(常規(guī)種)、花期(雜交種)或食用器官成熟期(瓜菜類)特征特性明顯的時(shí)期進(jìn)行鑒定。不同作物需要鑒定品種不同的特征特性，品種特征特性分為主要特征和次要特征，主要特征用于鑒定品種間的明顯特征特性，當(dāng)主要特征不存在差異時(shí)，宜使用次要特征進(jìn)行鑒定。小區(qū)種植鑒定特征特性表參見附錄D。6.2.6鑒定記錄根據(jù)比較小區(qū)典型株特征特性，記錄品種間性狀差異，可用比較性用語表示，如與標(biāo)準(zhǔn)樣品相比，鑒定品種穗位偏高。開展多次鑒定的，應(yīng)記錄每次鑒定情況，并以最適宜鑒定時(shí)期的結(jié)果為主。7結(jié)果計(jì)算與表示7.1結(jié)果計(jì)算對于DNA分子檢測法，統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異的引物編號結(jié)果，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)目或位點(diǎn)相似度；對于小區(qū)種植鑒定法，統(tǒng)計(jì)性狀差異結(jié)果。7.2結(jié)果表示對于DNA分子檢測法，品種真實(shí)性鑒定可視引物數(shù)量的大小，可選用下列的差異位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)相似度的方式表示：a)對于引物數(shù)目較少的，選用差異位點(diǎn)數(shù)目表示；b)對于引物數(shù)目較多的，選用位點(diǎn)相似度表示，即未判定差異位點(diǎn)數(shù)占檢測位點(diǎn)數(shù)的百分比。對于小區(qū)種植鑒定法，采用性狀差異類型、表現(xiàn)和數(shù)量表示。8結(jié)果報(bào)告8.1結(jié)果信息8.1.1檢測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)φ諛悠繁容^的鑒定選擇下列方式之一進(jìn)行填報(bào)：利用XX分子標(biāo)記法，通過檢測YY個(gè)位點(diǎn)，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品（對照樣品）比較，檢測出差異位點(diǎn)數(shù)為ZZ個(gè)；利用XX分子標(biāo)記法，通過檢測YY個(gè)位點(diǎn)，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品（對照樣品）比較，檢測出位點(diǎn)相似度為ZZ%。利用小區(qū)種植鑒定法進(jìn)行鑒定，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品（對照樣品）比較，檢測出差異性狀數(shù)為MM個(gè)，差異表現(xiàn)為NN。如需形成結(jié)論，結(jié)論可表述為品種真實(shí)性符合/不符合、品種間有差異/無差異/不確定。注：XX是分子標(biāo)記方法名稱，YY是位點(diǎn)個(gè)數(shù)，ZZ為差異位點(diǎn)數(shù)或位點(diǎn)相似度百分?jǐn)?shù)，MM為差異8.1.2檢測樣品和數(shù)據(jù)平臺。比較的鑒定利用XX分子標(biāo)記，通過檢測YY個(gè)位點(diǎn)，待測樣品與DNA指紋數(shù)據(jù)庫篩查比對，待測樣品不排除與AA為同一品種，或者不同于庫內(nèi)已有品種。注：XX是分子標(biāo)記方法名稱，YY是位點(diǎn)8.1.3特殊情形在位點(diǎn)差異閾值或容許誤差有明確規(guī)定時(shí)，可據(jù)其規(guī)定形成結(jié)果表述。8.2附加信息屬于下列情形之一（不限于）的，需在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：送驗(yàn)樣品低于規(guī)定數(shù)量的；鑒定樣品遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的混雜位點(diǎn)的引物編號清單；鑒定采用了其他引物的名稱及序列。（規(guī)范性）主要農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定SSR引物信息A.1玉米SSR引物信息表A.1玉米SSR引物名稱和序列度bnlg439w1NEDbnlg1940k7umc2105k3phi053k2NEDphi072k4VICbnlg2291k4VICumc1705w1VICbnlg2305k4NEDbnlg161k8VICbnlg1702k1VICNEDVICbnlg240k1反向：GGAACTGAAGAACAGAAGphi065k9NED反向：GGCCATGATACAGCAA反向：GTTTCCTATGGTACAGNEDphi96100y1umc1536k9正向：TGATAGGTAGTTAGCAGAGCATAGAAAAAGTTGAGGTNEDbnlg1520K1表A.1玉米SSR引物名稱和序列（續(xù)）umc1489y3NEDbnlg490y4NEDumc1999y3umc1429y7bnlg249k2phi299852y2umc2160k3umc1936k4bnlg2235y5phi233376y1NEDumc1231k4phi041y6NEDA.2水稻SSR引物信息表A.2水稻SSR引物名稱和序列1VIC2NED34VIC56VIC7VIC89VIC12345NED678VIC9VICNEDNED表A.2水稻SSR引物名稱和序列（續(xù)）123NED45678NED9NED1122334579NEDA.3小麥SSR引物信息表A.3小麥引物名稱和序列NEDbarc80NEDNEDVICVICVICbarc91NEDVICNEDVICbarc198NEDbarc240NEDNEDbarc324NEDbarc164NEDVICbarc170VICVICNEDbarc345VICVICSSR標(biāo)記鑒定程序B.1引物合成根據(jù)不同的電泳方法合成相應(yīng)要求的引物，選用變性PAGE電泳和瓊脂糖電泳，只需合成普通引物，采用單引物電泳。選用熒光毛細(xì)管電泳，需在上游引物的5’端標(biāo)記熒光染料合成引物，采用單引物或組合引物電泳。B.2DNA提取達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法均適用。B.3基因分型B.3.1PCR擴(kuò)增B.3.1.1反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和組分的終濃度參照表B.1進(jìn)行配量，可以依據(jù)試驗(yàn)條件不同作相應(yīng)調(diào)整。表B.1中的緩沖液若含有MgCl2，不再加MgCl2溶液，加等體積表B.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系--222B.3.1.2反應(yīng)程序反應(yīng)程序的反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號、酶、引物等不同而作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。通常采用下列反應(yīng)程序：a)預(yù)變性：94℃5min；b)擴(kuò)增：94℃變性40s，50℃~67℃（根據(jù)各引物設(shè)定退火溫度）退火35s，72℃延伸45s，進(jìn)行35次循環(huán)；c)終延伸：72℃10min。d)形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。B.3.2擴(kuò)增產(chǎn)物分離B.3.2.1熒光毛細(xì)管電泳由于各作物SSR擴(kuò)增片段大小范圍較廣，可以依據(jù)不同儀器選擇采用不多于10種的組合引物進(jìn)行電泳。按照預(yù)先確定的組合引物，分別取等體積的同一組合引物的不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，充分混勻。從混合液中吸取1μL，加入到DNA分析儀專用96孔板孔中。各孔再分別加入0.1μL分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺，在PCR儀上95℃變性5min，取出立即置于冰上，冷卻10min以上。瞬時(shí)離心10s后供備用。打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài)。將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座上，打開數(shù)據(jù)收集軟件，按照DNA分析儀使用手冊進(jìn)行操作。DNA分析儀將自動運(yùn)行參數(shù)，并保存電泳原始數(shù)據(jù)文件。B.3.2.2變性聚丙烯酰胺凝膠電泳B.3.2.2.1制膠沾洗滌靈用清水將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用雙蒸水、75%乙醇分別擦洗兩遍。玻璃板干燥后，將1mL親和硅烷工作液均勻涂在長玻璃板上，將1mL疏水硅烷工作液均勻涂在帶凹槽的短玻璃板上，玻璃板干燥后，將0.4mm厚的塑料隔條整齊放在長玻璃板兩側(cè)，蓋上凹槽短玻璃板，用夾子固定，用水平儀檢測玻璃膠室是否水平。取80mL6%的聚丙烯酰胺變性凝膠溶液，加入60μL的TEMED、180μL10%的過硫酸銨（過硫酸銨的用量與溫度成反比，需根據(jù)溫度調(diào)整用量），輕輕搖勻（勿產(chǎn)生大量氣泡），將膠灌滿玻璃膠室，在凹槽處將鯊魚齒梳的平齊端插入膠液約5mm～6mm。膠聚合1.5h后，輕輕拔出梳子，用清水洗干凈備用。注：為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議玻璃板的B.3.2.2.2變性4℃冷卻10min后供備用。B.3.2.2.3電泳在電泳正極槽（下槽）加入1極槽（下緩沖液600mL，負(fù)極槽（上槽）加入經(jīng)65℃預(yù)熱的1熱的槽（緩沖液600mL，拔出樣品梳，在90W恒功率下預(yù)電泳（10～20）min，用移液器吹或吸清除加樣槽孔氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳（齒朝下）。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μL樣品，在80W恒功率下進(jìn)行電泳。電泳的適宜時(shí)間，參考二甲苯青指示帶移動的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小范圍（參見表B.1）加以確定。二甲苯青指示帶在4.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中,所移動的位置與150bp擴(kuò)增產(chǎn)物泳動的位置大致相當(dāng)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小在（150當(dāng)。擴(kuò)）bp、（250當(dāng)。擴(kuò)）bp、（350當(dāng)。擴(kuò)）bp范圍的，指示帶從上到下應(yīng)分別到達(dá)膠板1/2、2/3、3/4處后，才可結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，取下玻璃板并輕輕撬開，通常凝膠附著在無凹槽的玻璃板上。B.3.2.2.4染色將附著凝膠的玻璃板浸入固定液中，輕輕晃動3min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時(shí)間不超過10s；將膠板放入染色液中，輕輕晃動5min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時(shí)間不超過10s；將膠板放入顯影液中，輕輕晃動待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗1min；取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈上觀察，記錄結(jié)果，拍照保存。注：固定液、染色液、雙蒸水和顯影液的用量，可依據(jù)膠板數(shù)量和大小B.3.3數(shù)據(jù)采集B.3.3.1電泳結(jié)果特別是毛細(xì)管電泳，需要通過規(guī)定程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析降低誤讀率。在引物等位變異片段大小范圍內(nèi)，對于毛細(xì)管電泳，特異峰呈現(xiàn)為穩(wěn)定的單峰或連續(xù)峰型；對于變性PAGE垂直板電泳，特異譜帶呈現(xiàn)穩(wěn)定的單譜帶或連續(xù)譜帶。注：當(dāng)出現(xiàn)非純合SSR位點(diǎn)時(shí)，毛細(xì)管電泳中會呈現(xiàn)兩個(gè)單峰或兩個(gè)連續(xù)峰，在變性PAGE垂直板電泳中會顯示為穩(wěn)定的兩種單譜帶或兩種連續(xù)譜帶。B.3.3.2對于毛細(xì)管電泳，由于不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)不同、引物不對稱擴(kuò)增、試驗(yàn)條件干擾等因素，可能出現(xiàn)不同狀況的峰型，按照以峰高為主、兼顧峰型的原則依據(jù)下列規(guī)則進(jìn)行甄別、過濾處置：1)對于連帶（pull-up）峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其它顏色熒光峰值升高的，應(yīng)預(yù)先將其干擾消除后再進(jìn)行分析；2)對于（n+1）峰，即同一位置出現(xiàn)兩個(gè)相距1bp左右的峰，應(yīng)視為單峰；3)對于連續(xù)多峰，即峰高遞增或峰高接近的相差一個(gè)重復(fù)序列的連續(xù)多個(gè)峰，應(yīng)視為單峰，取其最右邊的峰，峰高值為連續(xù)多個(gè)峰的疊加值；4)對于高低峰，應(yīng)通過設(shè)定一定閾值不予采集低于閾值的峰；5)對于有2個(gè)及以上特異峰，應(yīng)考慮是由非純合SSR位點(diǎn)或混入雜株所致。B.3.3.3對于變性PAGE垂直板電泳，位于相應(yīng)等位變異擴(kuò)增片段大小范圍之外的譜帶需要甄別是非特異性擴(kuò)增還是新增的稀有等位變異。采用單個(gè)個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物，出現(xiàn)3種及3種以上的多帶則為非特異性擴(kuò)增；采用混合樣提取的，某些位點(diǎn)出現(xiàn)3種及3種以上的譜帶或上下有弱帶等情況出現(xiàn)時(shí)，則需要通過單個(gè)個(gè)體進(jìn)行甄別。B.3.3.4導(dǎo)出電泳原始數(shù)據(jù)文件，采用數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行甄別：a)設(shè)置參數(shù)：在數(shù)據(jù)分析軟件中預(yù)先設(shè)置好panel、分子量內(nèi)標(biāo)、panel的相應(yīng)引物的Bin（等位變異片段大小范圍區(qū)間）；b)導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)文件：將電泳原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入分析軟件，選擇panel、分子量內(nèi)標(biāo)、Bin、質(zhì)量控制參數(shù)等進(jìn)行分析；c)甄別過濾處置數(shù)據(jù)：執(zhí)行B.3.3.1的規(guī)定。分析軟件會對檢測質(zhì)量賦以顏色標(biāo)志進(jìn)行評分，綠色表示質(zhì)量可靠無需干預(yù)，紅色表示質(zhì)量不過關(guān)或未落入Bin范圍內(nèi)，黃色表示有疑問需要查驗(yàn)原始圖像進(jìn)行確認(rèn)。數(shù)據(jù)比對采用B.3.3.1.1和B.3.3.1.2方式的，應(yīng)分別通過同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品、參照樣品（依據(jù)引物選擇少量的對照校準(zhǔn)不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴(kuò)增片段大小。甄別后的特異峰落入Bin范圍內(nèi)，直接讀取擴(kuò)增片段大?。蝗羝浞宕蠖嗖辉贐in范圍內(nèi)，可將其整體平移盡量使峰落入Bin設(shè)置范圍內(nèi)后讀取數(shù)據(jù)。B.3.3.5采用變性PAGE垂直板電泳，對甄別后的特異譜帶（見B.3.3.1）進(jìn)行讀取。擴(kuò)增片段大小的讀取，應(yīng)對照同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)的參照樣品的擴(kuò)增片段大小進(jìn)行讀取。（規(guī)范性）SNP分子標(biāo)記鑒定程序C.1引物合成根據(jù)不同的檢測技術(shù)合成相應(yīng)要求的引物或探針。選用熒光原位掃描檢測技術(shù)，如KASP技術(shù)，需合成兩條末端堿基不同的等位變異正向引物與一條反向引物，合成帶有不同熒光的兩條檢測通用引物。選用芯片檢測技術(shù)，需設(shè)計(jì)特異探針，并與芯片連接，訂制特異性的芯片。C.2DNA提取DNA提取方法應(yīng)保證提取的DNA質(zhì)量和