細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)溶酶體

實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞內(nèi)溶酶體

和線粒體的熒光活體染色實(shí)驗(yàn)原理Lyso-TrackerRed是一種溶酶體(lysosome)紅色熒光探針，可以用于活細(xì)胞溶酶體特異性熒光染色。

Lyso-TrackerRed為采用MolecularProbes公司的DND99進(jìn)行了熒光標(biāo)記的帶有弱堿性的熒光探針，可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于溶酶體的特異性熒光標(biāo)記。中性紅(Neutral

Red)和吖啶橙(AcridineOrange)也都可以對(duì)溶酶體進(jìn)行熒光染色，但中性紅和吖啶橙的染色缺乏特異性。

實(shí)驗(yàn)原理

Mito-TrackerGreen是一種線粒體(mitochondria)綠色熒光探針，可以用于活細(xì)胞線粒體特異性熒光染色。

Mito-Tracker

Green為采用Molecular

Probes公司的carbocyanine進(jìn)行了熒光標(biāo)記的一種Mito-Tracker，分子量為671.88，可以用作線粒體特異性的熒光探針。和rhodamine

123或JC-1相比，Mito-TrackerGreen對(duì)于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位。

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握熒光顯微鏡工作的原理了解細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的分布Lyso-TrackerRed工作液的配制：

a.取少量Lyso-TrackerRed按照1:13333-1:20000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為50-75nM。例如取1μlLyso-TrackerRed加入到20ml或13.33ml細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中。混勻后即為Lyso-TrackerRed工作液。HBSSwithCa2+&Mg2+(C0219)可以向2.溶酶體的熒光標(biāo)記：a.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟1配制好的并37℃預(yù)溫育的Lyso-TrackerRed染色工作液，與細(xì)胞37℃共孵育30-120分鐘。b.去除Lyso-TrackerRed染色工作液，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。c.隨后通常用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到溶酶體呈明亮的強(qiáng)熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Lyso-TrackerRed染色工作液中Lyso-TrackerRed的濃度或在推薦的時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長染色時(shí)間。使用說明：

1.Mito-TrackerGreen儲(chǔ)存液的配制：用無水DMSO(anhydrousdimethylsulfoxide)配制Mito-TrackerGreen至終濃度為1mM。配制后可以-20℃或更低溫度避光保存。2.Mito-TrackerGreen工作液的配制：a.取少量1mMMito-TrackerGreen儲(chǔ)存液按照1:5000-1:50000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為20-200nM。例如取1μlMito-TrackerGreen加入到50ml或5ml細(xì)胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中?；靹蚝蠹礊镸ito-TrackerGreen工作液。HBSSwithCa2+&Mg2+(C0219)可以向碧云天訂購。b.Mito-TrackerGreen工作液使用前需37℃預(yù)溫育。注：工作液中Mito-TrackerGreen的濃度可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。為降低背景，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Mito-TrackerGreen。3.線粒體的熒光標(biāo)記：a.去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入步驟2配制好的并37℃預(yù)溫育的Mito-TrackerGreen染色工作液，與細(xì)胞37℃共孵育15-45分鐘。b.去除Mito-TrackerGreen染色工作液，加入37℃預(yù)溫育的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。c.隨后通常用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)可觀察到