酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展培訓(xùn)課件

酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展內(nèi)容一、免疫分析的發(fā)展歷史二、免疫分析技術(shù)的種類三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史四、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的應(yīng)用五、酶免疫分析技術(shù)的類型六、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的設(shè)備七、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的材料及物品八、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的未來發(fā)展九、科樂士全自動(dòng)酶免疫分析系統(tǒng)的特點(diǎn)十、科樂士產(chǎn)品的市場推廣視角與辯點(diǎn)2024/3/212酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展一、免疫分析的發(fā)展歷史

免疫學(xué)發(fā)展簡史開創(chuàng)階段：公元10～18世紀(jì)，天花痘痂預(yù)防開花。興起階段：公元18世紀(jì)～20世紀(jì)中葉，牛痘苗預(yù)防天花，發(fā)

現(xiàn)細(xì)菌，建立感染免疫，細(xì)胞免疫和體液免疫學(xué)

說，變態(tài)反應(yīng)，免疫化學(xué)。飛躍階段：從1908年埃利希提出側(cè)鏈學(xué)說開始，對(duì)免記憶、

免疫識(shí)別，免疫耐受、自身免疫、免疫移植等?，F(xiàn)代階段：從1957年開始，各種新型免疫分析技術(shù)、免疫學(xué)

說、理論、臨床應(yīng)用、疾病診治等取得重大進(jìn)展。2024/3/213酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

根據(jù)所用的技術(shù)和方法，免疫學(xué)的發(fā)展歷史可分為三個(gè)時(shí)期：一、免疫學(xué)的經(jīng)驗(yàn)時(shí)期（17世紀(jì)-19世紀(jì)）

1.用人痘苗接種預(yù)防天花。（中國民間）

2.接種牛痘苗預(yù)防天花。Jenner

免疫發(fā)展歷史中的重要發(fā)現(xiàn)和發(fā)明及人物4酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展5酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展6酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展7酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

二、經(jīng)典免疫學(xué)時(shí)期（19世紀(jì)中葉-20世紀(jì)中葉）

免疫學(xué)與微生物學(xué)互相促進(jìn)、共同發(fā)展*多種病原菌被發(fā)現(xiàn)；*“病原菌致病”概念的提出；*疫苗的發(fā)明；*細(xì)胞吞噬作用的發(fā)現(xiàn)（細(xì)胞免疫）；*

免疫血清具有抵御病原菌的作用（體液免疫）；*免疫化學(xué)研究取得重大進(jìn)展；*初步認(rèn)識(shí)多種免疫學(xué)現(xiàn)象的本質(zhì)。8酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展EliMetchnikoff(1845-1916)EmilvonBehring(1845-1917)RobertKoch(1843-1910)PaulEhrilich(1854-1915)提出體液免疫理論和抗體生成的側(cè)鏈學(xué)說發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬作用，提出細(xì)胞免疫理論發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌；提出病原菌致病的概念發(fā)現(xiàn)抗毒素并治愈一名白喉患者9酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

實(shí)際上，與此同時(shí)，人們也發(fā)現(xiàn)除了微生物之外的其它物質(zhì)也能引起免疫現(xiàn)象，過敏現(xiàn)象有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，如血型不符的輸血、器官移植排斥反應(yīng)、血清病等；Koch在發(fā)現(xiàn)了結(jié)核桿菌之后，試圖用注射的方法使動(dòng)物產(chǎn)生免疫，但注射局部卻出現(xiàn)了組織損傷和壞死。以上事實(shí)揭示出兩個(gè)問題：第一,免疫不一定僅僅由微生物引起;第二,免疫對(duì)機(jī)體不一定總是有利的，也可以是有害的。至此，經(jīng)典的免疫概念被動(dòng)搖了，那么，免疫究竟是機(jī)體防御微生物侵襲的特有成分？還是機(jī)體識(shí)別“自己”和“非己”的普遍生物學(xué)現(xiàn)象？這個(gè)問題必須有一個(gè)明確的答案。10酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展三.近代免疫學(xué)和現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期

（20世紀(jì)中葉—現(xiàn)在）

特異性細(xì)胞的免疫功能、天然和獲得性免疫耐受現(xiàn)象、抗體生成克隆學(xué)說、細(xì)胞克隆選擇學(xué)說（clonalselection）*Burnet（1957年）提出克隆選擇學(xué)說；*從器官、細(xì)胞和分子水平探討免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能。MacFarlaneBurnet（1899-1985）11酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展克隆選擇學(xué)說(clonalselectionhypothesis)的基本觀點(diǎn)：1.機(jī)體內(nèi)存在有能識(shí)別多種抗原的細(xì)胞系（clone），其細(xì)胞表面有識(shí)別抗原的特異性受體（recepter)。

2.抗原進(jìn)入機(jī)體后，選擇具有相應(yīng)受體的免疫細(xì)胞與之結(jié)合，使該細(xì)胞系活化、增殖，并成為抗體產(chǎn)生細(xì)胞和記憶細(xì)胞。

3.若在胚胎期，某抗原選擇相應(yīng)克隆接觸后，該細(xì)胞系就被排除或失去活性，處于抑制狀態(tài)，稱此為禁忌克隆（forbiddenclone），使機(jī)體失去針對(duì)該抗原的反應(yīng)性，形成免疫耐受。解釋了天然免疫耐受現(xiàn)象。

4.某些克隆可發(fā)生突變，而與自身組織發(fā)生反應(yīng)，形成自身免疫應(yīng)答。

1960年，Burnet和Medawar獲諾貝爾獎(jiǎng)。12酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展雞法氏囊及哺乳動(dòng)物胸腺的免疫功能的認(rèn)識(shí)淋巴細(xì)胞免疫功能的確認(rèn)巨噬細(xì)胞抗原提呈作用的揭示細(xì)胞因子的研究免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說單克隆抗體制備技術(shù)的問世免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展（單克隆抗體標(biāo)記技術(shù)、免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)、分子雜交技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)等）。13酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展20世紀(jì)獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家

年代 學(xué)者姓名 國家 獲獎(jiǎng)成就

1901 Behring 德國 發(fā)現(xiàn)抗毒素，開創(chuàng)免疫血清療法

1905 Koch 德國 發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌，發(fā)明診斷結(jié)核病的結(jié)核菌素

1908 Ehrlich 德國 提出抗體生成側(cè)鏈學(xué)說和體液免疫學(xué)說

Metchnikoff 俄國 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬作用，提出細(xì)胞免疫學(xué)說

1912 Carrel 法國 器官移植

1913 Richet 法國 發(fā)現(xiàn)過敏現(xiàn)象

1919 Bordet 比利時(shí) 發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體,建立補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

1930 Landsteiner 奧地利 發(fā)現(xiàn)人紅細(xì)胞血型

1951 Theler 南非 發(fā)明黃熱病疫苗

1957 Bovet 意大利 抗組胺藥治療超敏反應(yīng)

1960 Burnet 澳大利亞 提出抗體生成的克隆選擇學(xué)說

Medawar 英國 發(fā)現(xiàn)獲得性移植免疫耐受性

1972 Edelman 美國 闡明抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Porter 英國 闡明抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)

14酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

20世紀(jì)獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)的免疫學(xué)家

1977 Yalow 美國 創(chuàng)立放射免疫測定法

1980 Dausset 法國 發(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞抗原

Snell 美國 發(fā)現(xiàn)小鼠H-2系統(tǒng)

Benacerraf 美國 發(fā)現(xiàn)免疫應(yīng)答的遺傳控制Jerne 丹麥 提出天然抗體選擇學(xué)說和免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說

Kohler 德國 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體

Milstein 阿根廷 單克隆抗體技術(shù)及Ig基因表達(dá)的遺傳控制

Tonegawa 日本 抗體多樣性的遺傳基礎(chǔ)

Murray 美國 第一例腎移植成功

Thomas 美國 第一例骨髓移植成功

1996 Doherty 澳大利亞 提出MHC限制性，即T細(xì)胞的雙識(shí)別模式

Zinkernagel 瑞士 提出MHC限制性，即T細(xì)胞的雙識(shí)別模式2024/3/21酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展1516酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史

1896年，Herbert發(fā)明特異性凝集現(xiàn)象,Widal發(fā)明Widal試驗(yàn)診斷

傷寒;1897年，Kmus發(fā)現(xiàn)鼠疫桿菌的培養(yǎng)濾液能與相應(yīng)抗血清發(fā)生沉淀

反應(yīng)；1898年,Kraus發(fā)明沉淀試驗(yàn)1899年，Bordet發(fā)現(xiàn)免疫溶血反應(yīng)1900年，Landsteiner在特異血凝現(xiàn)象的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了人類ABO血

型，1930年獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1902年，Ascoli建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)1905年，Bechhold建立了明膠沉淀試驗(yàn)1906年，Wassermann發(fā)明梅毒補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)2024/3/2117酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史1935年，Heidelberger，純化抗體技術(shù)，定量沉淀反應(yīng)1942年，Coons建立了熒光素標(biāo)記技術(shù)1946年，Oudin建立了試管單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1951年，Ouchterlony建立了雙向平板法雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1953年，Grabar建立了免疫電泳1953年，Crabar與Williams建立補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)1959年，Singer首創(chuàng)免疫電鏡技術(shù)1960年，Yalow建立了放射免疫標(biāo)記測定技術(shù)2024/3/2118酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展免疫分析技術(shù)的發(fā)展歷史1965年，Mancini建立了平板單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)1971年，Engvall和

Perlmann，VanWeeman和

Schuurs建立了酶標(biāo)記的固相免疫測定技術(shù)

（ELISA）1971年，Rubenstein等建立了均相酶免疫測定技術(shù)1975年，Koher和Milstein，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗

體1980年，Tonegawa，免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)

······2024/3/2119酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）標(biāo)記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性半自動(dòng)、自動(dòng)化檢驗(yàn)儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了反應(yīng)過程標(biāo)記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動(dòng)化技術(shù)的最佳組合

免疫技術(shù)發(fā)展的發(fā)展進(jìn)程20酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展二、免疫分析技術(shù)的種類

分為兩大類別：細(xì)胞免疫測定技術(shù)和體液免疫測定技術(shù)。

體液免疫技術(shù)又可分為體內(nèi)法和體外法。體外法即體外抗原抗體反應(yīng)，包括抗原、抗體、補(bǔ)體以及其他有關(guān)因素的定量、半定量或定性測定方法，舊稱血清學(xué)反應(yīng)；體內(nèi)法則利用皮膚試驗(yàn)進(jìn)行檢測。

細(xì)胞免疫測定也可以分為體外法和體內(nèi)法兩類。2024/3/2121酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展1、免疫沉淀技術(shù)

包括液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)、免疫電泳、免疫比濁等。其中在經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)基礎(chǔ)上，又衍生出對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳、交叉免疫電泳、免疫固定電泳等許多新技術(shù)和新方法出現(xiàn)。免疫濁度法則可以分為免疫透射濁度、免疫乳膠濁度和免疫速率濁度測定法等。2024/3/2122酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展2、免疫凝集技術(shù)括血凝、膠凝、菌凝、碳凝等微粒技術(shù)。其中磁性微粒(magneticmicrospheres,MMS)是80年代初，用高分子材料和金屬離子為原料，聚合而成的一種以金屬離子為核心，外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。在液相中，受外加磁場的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分離，無需進(jìn)行離心沉淀。因此，將MMS應(yīng)用于免疫檢測，可使操作過程大為簡化。2024/3/2123酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展3、放射免疫技術(shù)

放射免疫測定法是以放射性同位素作為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫測定方法，一般可以分為三種類型：1、以同位素標(biāo)記抗原和受檢測標(biāo)本中的抗原與抗體競爭結(jié)合的經(jīng)典放射免疫測定法，RIA。2、以同位素標(biāo)記的抗體與受檢標(biāo)本中的抗原結(jié)合，然后用固相抗原分離游離的標(biāo)記抗體的免疫放射測定，IRMA。3、以同位素標(biāo)記的抗原或抗體及固相的抗原或抗體作為試劑，按固相酶免疫疫測定相似的方式檢測受檢標(biāo)本中的抗原或抗體的固相放射測定，SPRIA。2024/3/2124酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展4、免疫熒光技術(shù)

分為免疫組織化學(xué)技術(shù)與免疫測定兩大類。免疫熒光測定分均相與非均相。非均相熒光免疫測定與ELISA極為相似，差別僅為標(biāo)記物和測定方式不同。而均相熒光免疫測定則有其特點(diǎn)，常用方式為時(shí)間分辨熒光法和均相熒光免疫測定。

熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)則與組織化學(xué)染色技術(shù)相似，最后用熒光顯微鏡判斷結(jié)果。

2024/3/2125酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展5、酶聯(lián)免疫技術(shù)

是以酶標(biāo)記抗體或抗原作為主要試劑的免疫測定方法。是標(biāo)記免疫技術(shù)應(yīng)用于最廣泛的一種，也是應(yīng)用最多的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。

有關(guān)該類方法原理、分類、應(yīng)用、特點(diǎn)、局限性等，將在后續(xù)介紹。2024/3/2126酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展6、免疫膠體金技術(shù)

是以膠體金標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體，對(duì)樣本中相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行檢測。檢測方法包括組織細(xì)胞染色、層析、斑點(diǎn)，均為非均相檢測法。未來可能發(fā)展均相檢測法。2024/3/2127酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展7、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

利用特異性抗體對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用需要補(bǔ)體參與而建立起來的一類檢測方法。主要包括補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和細(xì)胞溶解反應(yīng)。

這類檢測參與的反應(yīng)物質(zhì)有5種成分：已知抗原或抗體，待測抗體或抗原，溶血素、補(bǔ)體、紅細(xì)胞。其中后起3種成份又稱為指示系統(tǒng)。發(fā)生溶血反應(yīng)為試驗(yàn)陰性，不發(fā)生溶血反應(yīng)為試驗(yàn)陽性。

2024/3/2128酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展8、中和試驗(yàn)

是用以測定抗體的中和能力的試驗(yàn)，即中某種抗原或中和攜帶該抗原的微生物的如病毒感染性或細(xì)菌毒素的生物學(xué)效應(yīng)能力的試驗(yàn)。其可以中和該抗原的生物學(xué)效應(yīng)之外，也可以用于疾病診斷或病毒鑒定。

該試驗(yàn)檢測的是中和指數(shù)，目前較少應(yīng)用。2024/3/2129酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展9、免疫組織化學(xué)

又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。2024/3/2130酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展10、免疫電鏡技術(shù)

是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合，在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行定位分析的一種高度精確、靈敏的方法。

特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。2024/3/2131酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展11、流式細(xì)胞技術(shù)

能快速、精確地測量通過檢測區(qū)液流中的各種粒子。這些粒子可以是細(xì)胞、大分子、乳膠滴或其他粒子。流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)。

通常是應(yīng)用一個(gè)激光和有關(guān)的光學(xué)檢測系統(tǒng)來收集這些信號(hào)以供分析。其檢測速度之快，統(tǒng)計(jì)學(xué)精度之高，是其他方法無法比擬的。它可以研究一個(gè)細(xì)胞從新生到死亡，從細(xì)胞膜到腦漿和核內(nèi)物質(zhì)及染色體，還可以探討不同物質(zhì)之間的關(guān)系。同時(shí)它還可以從一個(gè)細(xì)胞中測得多種參數(shù)(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等)，進(jìn)行多信息分析，為細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究提供強(qiáng)而有力的手段。2024/3/2132酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展12、免疫印跡技術(shù)

又稱蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting），是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白（抗原）的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）或非變性電泳（Native

）等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。2024/3/2133酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的發(fā)展

對(duì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的文獻(xiàn)分析

Fifa在Pub-Med檢索系統(tǒng)中輸入“enzyme-immunoassay”，“enzyme-linkedimmunoasay”，“RIA”三個(gè)單詞，從1965日至2005年，以每五年為一個(gè)階段，檢索了期間發(fā)表的論文，結(jié)果令人驚異。RIA法的高峰處在80年到90年之間，90年之后到2000年論文數(shù)量逐漸減少。而以EIA或者ELISA為關(guān)鍵詞的文章，在80年以后迅速增長，90年代以后穩(wěn)定在每5年4萬篇左右，目前還未見有下降的趨勢。2024/3/2134酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展四、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的應(yīng)用

均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。

非均相免疫測定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。2024/3/2135酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：

免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性原理及特點(diǎn)2024/3/2136酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物酶和酶作用底物2024/3/2137酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的特點(diǎn)

特異性高靈敏度高穩(wěn)定性好操作簡便對(duì)環(huán)境污染小成本較低2024/3/2138酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、

準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)

間保持穩(wěn)定操作簡便、對(duì)環(huán)境沒有

污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣

的新方法。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點(diǎn)2024/3/2139酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的局限性

洗滌損失影響因素較多定性試驗(yàn)的陰性、陽性判定值與均相方法比較，定量檢測中的準(zhǔn)確度、精密度及線性尚欠理想。

2024/3/2140酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析的產(chǎn)品

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前用ELISA技術(shù)建立或開發(fā)的檢測項(xiàng)目多達(dá)千余項(xiàng)，通過商業(yè)機(jī)構(gòu)可購的檢測試劑盒多達(dá)300種，其中常用的檢測試劑盒有近100余種。概括起來，可以這樣描述，凡是可以取得抗原物質(zhì)的所有物品，幾乎都可以建立ELISA檢測方法。2024/3/2141酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展五、酶免疫分析技術(shù)的分類2024/3/2142酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量2024/3/2143酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理（一）均相酶免疫測定2024/3/2144酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定2024/3/2145酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物（二）非均相酶免疫測定2024/3/2146酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234ELISA基本原理2024/3/2147酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個(gè)必要試劑

方法類型及其反應(yīng)原理2024/3/2148酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（1）雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶

標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等A、ELISA檢測抗原的方法2024/3/2149酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展2024/3/2150酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2024/3/2151酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（2）競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)

抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合

加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（

藥物、激素等）A、ELISA檢測抗原的方法2024/3/2152酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展2024/3/2153酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE2024/3/2154酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（1）間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG

（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定B、ELISA檢測抗體的方法2024/3/2155酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展2024/3/2156酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+2024/3/2157酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（2）雙抗原夾心法原理類似雙抗體夾心法操作步驟類似應(yīng)用乙型肝炎表面抗體B、ELISA檢測抗體的方法2024/3/2158酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（3）競爭法原理類似檢測抗原的競爭法

應(yīng)用乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和

乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測B、ELISA檢測抗體的方法2024/3/2159酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展

（4）捕獲法

應(yīng)用病原體急性感染診斷中的IgM型抗體甲型肝炎HAV-IgM抗體乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體B、ELISA檢測抗體的方法2024/3/2160酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色

2024/3/2161酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色2024/3/2162酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展六、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的設(shè)備

1、加樣器2、洗板機(jī)3、孵育箱4、加速儀5、酶免分析儀6、數(shù)據(jù)分析方法7、結(jié)果報(bào)告系統(tǒng)2024/3/2163酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展七、酶聯(lián)分析所需使用的材料

（1）抗原：純化抗原、合成抗原、基因工程抗原。（2）抗體：多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體。（3）酶標(biāo)抗體或抗原：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、

B-半乳糖苷

酶等。（4）酶色原底物：鄰苯二胺（OPD）、ABTS、四甲基聯(lián)苯胺

（TMB）；對(duì)硝基苯磷酸鹽（pNPP）,酶發(fā)光底物（魯米諾、

AMPPD）。（5）微孔反應(yīng)板（6）洗滌液、終止劑（7）陽性質(zhì)控品（8）陰性質(zhì)控品2024/3/2164酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展標(biāo)記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉

（一）酶和酶作用底物2024/3/2165酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶常用酶酶和酶作用底物2024/3/2166酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常用酶酶和酶作用底物2024/3/2167酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物2024/3/2168酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展AP的底物

β-Gal的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。常用底物酶和酶作用底物2024/3/2170酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

（二）酶標(biāo)記抗體或抗原2024/3/2171酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

制備方法要求酶標(biāo)記抗體或抗原2024/3/2172酶聯(lián)免疫技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)展制備方法要求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物酶標(biāo)記抗體或抗原2024